2. 福建医科大学基础医学院生理学与病理生理学系, 福建 福州 350108;
3. 湖北省第三人民医院肾内科, 湖北 武汉 430033
2. Dept of Physiology and Pathophysiology, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China;
3. Dept of Nephrology, The Third People′s Hospital of Hubei Province, Wuhan 430033, China
以柔红霉素(daunorubicin，DNR)、阿霉素为代表的蒽环类药物(anthracyclines，ANT)具有广谱抗肿瘤作用，是许多肿瘤化疗方案的基础性用药。心脏毒性是蒽环类药物化疗中最常见和严重的不良反应，目前尚无有效的临床防治措施。蒽环类药物心脏毒性(anthracycline induced cardiotoxicity，AIC)发病机制非常复杂，涉及心肌细胞活性氧累积、钙稳态破坏、炎症免疫、心肌细胞凋亡等多种途径[1-2]。新近发现，抑制或降低天然和获得性免疫、调节炎症反应的药物有助于减少肿瘤幸存者心脏相关死亡[2-3]。
环孢素A(cyclosporin A，CsA)是移植排异反应和免疫性疾病常用的强效免疫抑制剂，还作为化疗增敏剂用于ANT耐药的防治[4-5]。现已发现，CsA对心肌缺血/再灌注损伤及心肌肥大具有一定的保护作用[6-8]。CsA对ANT心肌损伤的作用尚不明确，相关资料很少，且存在一定的争议[9-12]。本研究以DNR处理H9c2细胞建立心肌损伤模型，观察CsA对细胞生存率、心肌损伤、氧化应激及细胞凋亡的影响，为综合评估CsA在AIC中的作用提供必要的依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞H9c2(2-1)大鼠心肌细胞株购自中国科学院细胞库。
1.1.2 主要试剂注射用盐酸柔红霉素购于山东新时代药业公司，批号：037170301。环孢素注射液购于瑞士Novartis Pharma公司，批号：SY695。NFAT抑制剂(VIVIT多肽，HY-P1026)购于美国MCE公司。胎牛血清(10099141C)购于美国Life Technologies公司。DMEM高糖培养基(#11995115)购于美国Invitrogen公司。MTS细胞增殖试剂盒(G5421)购于美国Promega公司。Bax(BM3964)、心房利尿钠肽(atrial natriuretic peptide，ANP)(A01318)抗体均购于武汉博士德生物工程公司。Bcl-2抗体购于亲科生物公司(AF6139)。β-actin(8H10D10)抗体购于美国Cell Signaling Technology公司。肌酸激酶(creatinekinase，CK)试剂盒(A032-1-1)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)(微板法)试剂盒(A020-2-2)均购于南京建成生物工程研究所。BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)、RIPA裂解液(P0013B)、Hoechst 33342染色液(C1025)、GreenNuc活细胞caspase-3活性检测试剂盒(C1168S)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒(S0033S)均购于碧云天生物技术研究所。
1.1.3 仪器恒温CO2细胞培养箱(德国Heraeus公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司)；蛋白电泳系统(美国BIO-RAD公司)；生物分子成像仪(日本GE Healthcare公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养及处理H9c2大鼠心肌细胞以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液培养。每2-3 d以0.25%胰酶消化传代1次。不同浓度CsA处理对数生长期、状态良好的H9c2心肌细胞2 h，再加入1 μmol·L-1 DNR共培养24 h。DNR组以1 μmol·L-1 DNR处理24 h，Control组加入等体积培养液。
1.2.2 MTS法测定细胞生存率细胞接种96孔板，每孔加入10 μL MTS工作液。置37 ℃环境孵育4 h，检测490 nm各孔光密度值(optical density，OD)。各实验组设4个复孔，空白组加入无细胞培养液及MTS溶液。细胞生存率/%=(OD处理组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。实验重复3次。
1.2.3 CK及LDH活性检测收集细胞制备裂解液，BCA法确定蛋白浓度，同时收集各实验组培养液上清。按说明书操作，测定各处理组细胞裂解液CK及培养液上清LDH活性。
1.2.4 免疫细胞化学检测95%乙醇固定细胞，依次加入过氧化酶阻断剂和封闭血清。4 ℃湿盒中一抗孵育过夜。二抗孵育30 min，链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶工作液孵育10 min。DAB显色，待出现明显棕色、背景无明显着色时中止显色。脱水封片，光镜下随机选取6个视野，计算平均光密度(IOD·Area-1)。
1.2.5 DCF-DA荧光检测细胞内ROS含量10 μmol·L-1 DCFH-DA染液37 ℃孵育20 min。激发波长488 nm，发射波长525 nm，激光共聚焦显微镜检测绿色荧光。随机选取10个视野，计算细胞平均荧光强度。
1.2.6 Hoechst 33342染色Hoechst 33342染色液避光孵育20 min。去除多余染液，PBS充分清洗。发射波长460 nm，激发波长350 nm，荧光显微镜观察。凋亡细胞核呈致密浓染颗粒块状亮蓝色荧光。镜下随机选取5个视野，计数凋亡细胞百分率。
1.2.7 caspase-3活性检测细胞处理完毕，更换含5 μmol·L-1 GreenNuc caspase-3底物的新鲜培养液，避光孵育30 min。发射波长515 nm，激发波长485 nm，激光共聚焦显微镜检测绿色荧光。随机选取10个视野，分析细胞核平均荧光强度。
1.2.8 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白含量收集各处理组细胞，RIPA裂解液冰上充分裂解30 min。取上清，BCA法定量蛋白浓度。样品与上样缓冲液按比例混合，沸水浴变性。上样(30-80) μg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h，湿转法电转印2 h至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶10 000比例稀释的Bax、Bcl-2、β-actin一抗4 ℃孵育过夜。HRP标记二抗孵育2 h。加入ECL-HRP发光底物，置生物分子成像仪中显影成像。
1.2.9 统计学分析数据以x±s描述，采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。组间比较采用方差分析和t检验。
2 结果 2.1 CsA提高DNR损伤H9c2心肌细胞生存率如Fig 1A所示，12.5-800.0 nmol·L-1 CsA处理H9c2细胞26 h，细胞生存率均无显著性改变(P＞0.05 vs Control)。
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| Fig 1 Effect of CsA on viability of H9c2 cells treated with DNR(x±s, n=4) A: Cells were treated with CsA in different concentrations. B: Cells pre-treated with CsA for 2h, followed by 1 μmol·L-1 DNR incubation. C: Cell viability time course of DNR injured H9c2 cells pre-treated with 100.0 nmol·L-1 CsA. **P < 0.01 vs Control; #P < 0.05, ##P < 0.05 vs DNR. |
如Fig 1B所示，DNR处理组细胞生存率降至71.71%，25.0、50.0、100.0 nmol·L-1 CsA预处理使细胞生存率升至(79.42±5.62)%、(82.15±7.78)%、(88.08±4.80)%(P < 0.05 vs DNR)。更高浓度CsA处理组细胞生存率较100.0 nmol·L-1 CsA处理组略低，但差别无显著性(P＞0.05 vs 100.0 nmol·L-1 CsA+DNR)。
进一步检测100.0 nmol·L-1 CsA预处理后，不同时间点DNR损伤H9c2心肌细胞生存率。DNR处理6、12、24 h，CsA+DNR组细胞生存率均高于同时期DNR组(P < 0.05 vs DNR)，整体细胞生存率降幅明显小于DNR组(Fig 1C)。
上述研究显示，100.0 nmol·L-1 CsA预处理2 h对DNR损伤H9c2心肌细胞生存率提升最为显著。后续研究采用100.0 nmol·L-1 CsA预处理H9c2心肌细胞，观察CsA对DNR损伤H9c2细胞心肌损伤指标、氧化应激、细胞凋亡等指标的影响。
2.2 CsA减轻DNR诱导的H9c2细胞损伤 2.2.1 CsA改善DNR损伤H9c2心肌细胞形态苏木精-伊红染色观察细胞形态。如Fig 2所示，正常对照组H9c2心肌细胞核质境界清晰，呈长梭状，细胞大小较均匀，形态规则，排列整齐。DNR组H9c2细胞失去正常长梭状形态，胞体明显皱缩或膨胀，大小不均，排列紊乱，核质固缩及胞质空泡化明显，凋亡小体多见。CsA+DNR组大部分细胞保有梭形的基本形态，核质固缩和胞质空泡化有所改善，凋亡小体少见。
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| Fig 2 Effect of CsA on morphology of H9c2 cells injured by DNR (Hematoxylin and eosin staining, Bar=50 μm) |
心肌酶肌酸激酶和乳酸脱氢酶是反映心肌细胞损伤的常用指标。分别检测培养液上清LDH以及心肌细胞裂解液CK含量，结果如Tab 1所示：DNR组培养液上清LDH和心肌细胞CK活性较对照组明显升高(P < 0.01 vs Control)。CsA+DNR组LDH和CK活性较DNR组明显降低(P < 0.05 vs DNR)。
| Group | LDH/U·L-1 | CK/kU·g-1 pro) |
| Control | 394.25±15.88 | 0.92±0.04 |
| DNR | 595.40±14.44** | 1.27±0.03** |
| CsA+DNR | 509.20±3.77## | 1.13±0.03# |
| **P＜0.01 vs control; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs DNR. | ||
如Fig 3所示，心房利钠尿肽是临床常用的心衰指标。免疫细胞化学结果显示，DNR组H9c2心肌细胞胞核和胞质呈现ANP阳性的棕黄色深染，平均光密度(IOD·Area-1)较对照组明显升高(P＜0.05 vs Control)。CsA+DNR组胞核和胞质棕黄色染色明显低于DNR组(P＜0.05 vs DNR)，平均光密度与对照组差异无显著性(P＞0.05 vs Control)。
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| Fig 3 Effect of CsA on ANP protein content in DNR injured H9c2 cells(x±s, n=6) Bar=50 μm. *P < 0.05 vs Control; #P < 0.05 vs DNR |
如Fig 4所示，荧光探针DCFH-DA负载后，激光共聚集显微镜检测心肌细胞ROS荧光值。DNR组DCFH-DA荧光强度明显升高，是Control组的4倍以上。CsA预处理明显降低了DNR损伤H9c2心肌细胞ROS含量，CsA+DNR组DCFH-DA荧光强度比DNR降低约64.94%(P < 0.001 vs DNR)。
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| Fig 4 Measurement of ROS in H9c2 cells with dichlorofluorescein fluorescence(x±s, n=10) Bar=50 μm. **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs DNR. |
如Fig 5所示，Control组细胞核基本呈现均匀淡蓝色，DNR组及CsA+DNR组可见数量不等的高亮度核染色质致密浓染或碎块状致密浓染的凋亡细胞，但CsA+DNR组心肌细胞凋亡率较DNR组降低约1/3(P < 0.01 vs DNR)。
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| Fig 5 Cellular apoptosis detected by Hoechst 33342 staining in H9c2 cells(x±s, n=5) Bar=100 μm. **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs DNR. |
检测caspase-3活性如Fig 6所示，Control组罕见caspase-3 Substrate绿色荧光的细胞。DNR组和CsA+DNR组H9c2细胞均可见caspase-3活化的绿色荧光。分析caspase-3 Substrate绿色荧光强度，Control组细胞caspase-3 Substrate绿色荧光强度极低，DNR组caspase-3 Substrate绿色荧光强度比Control组升高20倍以上，CsA+DNR组荧光强度较DNR组降低约26%(P < 0.01 vs DNR)。
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| Fig 6 Effect of CsA on caspase-3 activity in DNR injured H9c2 cells(x±s, n=10) Bar=50 μm. **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs DNR. |
如Fig 7所示，Control、DNR、CsA+DNR组心肌细胞Bax蛋白含量未见显著性变化。DNR组Bcl-2蛋白含量明显低于Control组，CsA+DNR组Bcl-2含量较DNR组明显升高(P＜0.05 vs DNR)。进一步比较Bax/Bcl-2比值，DNR组Bax/Bcl-2比值约为Control组的6倍，CsA+DNR组Bax/Bcl-2比值较DNR组降低一半以上(P＜0.05 vs DNR)。
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| Fig 7 Effect of CsA on Bax and Bcl-2 protein content in DNR injured H9c2 cells(x±s, n=3) A: Representative Western blot bands. B: Statistical analysis of Bax and Bcl-2 protein level. C: Statistical analysis of Bax/Bcl-2 ratio. *P < 0.05 vs Control; #P < 0.05 vs DNR. |
CsA是钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)的药理学抑制剂。T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFATs)是CaN重要的下游底物。我们引入NFAT抑制剂VIVIT多肽，初步分析CsA对DNR损伤H9c2心肌细胞的保护作用是否与CaN-NFAT信号通路有关。
如Fig 8所示，100.0 μmol·L-1 VIVIT多肽处理H9c2细胞2 h，再加入DNR共培养24 h，细胞生存率明显高于DNR处理组(P＜0.01, VIVIT+DNR vs DNR)，与CsA+DNR组差异无显著性(P＞0.05, VIVIT+DNR vs CsA+DNR)。VIVIT多肽处理1 h先行抑制NFAT，再以CsA处理2 h，VIVIT+CsA+DNR处理组细胞生存率与CsA+DNR组及VIVIT+DNR组差异均无显著性。说明阻断NFAT背景下，CsA不能再进一步增加DNR损伤H9c2心肌细胞生存率。
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| Fig 8 Effect of VIVIT peptide on viability of DNR injured H9c2 cells(x±s, n=4) **P < 0.01 vs Control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs DNR. |
本研究利用DNR损伤H9c2心肌细胞模型，研究CsA对ANT心肌损伤的影响。研究发现25.0-800.0 nmol·L-1 CsA能不同程度提高DNR损伤H9c2大鼠心肌细胞的生存率，25.0-100.0 nmol·L-1浓度区间内具有较好的量效对应关系。CsA还能减少DNR诱导的LDH外漏，降低心肌细胞CK及ANP含量，改善心肌细胞形态结构。上述结果提示，体外条件下CsA减轻了DNR对H9c2心肌细胞的损伤。
有文献报道，CsA对心脏具有潜在的毒性。CsA心脏毒性具有很强的异质性，常在高剂量使用时出现，可导致心肌损伤和纤维化[13]。临床资料显示，CsA作为化疗增敏剂使用不增加高剂量ANT化疗的心脏毒性，对静息和负荷状态的左室射血分数还具有正向影响[14]。但现有资料尚不足以完全排除AIC背景下CsA心脏毒性的可能。CsA是重要的药理学工具药，体外推荐剂量在100 nmol·L-1左右。本研究发现12.5-800.0 nmol·L-1 CsA不降低正常及DNR损伤的H9c2细胞生存率，一定程度提示该剂量范围内CsA不产生额外的心脏毒性，是较为安全的体外用药区间。
过度氧化应激和细胞凋亡是AIC的主要发病机制。ANT加剧线粒体内的铁累积与无效氧化还原循环，增加活性氧的产生。心肌细胞由于线粒体代谢活性高、抗氧化能力低，极易受到ROS的损害。ROS进一步诱导AIC心肌细胞凋亡和坏死，造成正常心肌细胞的大量丢失，加剧心脏结构和功能损害[1]。多种疾病模型中，CsA被发现能影响线粒体氧化磷酸化偶联，减少ROS生成、抑制细胞凋亡[6, 15]。本研究发现，CsA明显降低了DNR损伤H9c2心肌细胞DCFH-DA荧光强度，抑制ROS生成。随着ROS水平的降低，CsA处理组H9c2心肌细胞凋亡状况明显改善，表现为抗凋亡蛋白Bcl-2含量增多，Bax/Bcl-2比值明显减小，caspase-3活化水平和凋亡细胞比例降低。CsA对H9c2心肌细胞氧化应激和细胞凋亡的影响也进一步证明CsA能减轻DNR诱导的心肌细胞损伤。
CsA调节氧化应激、细胞凋亡、减轻ANT心肌损伤的机制还远未明确。继往研究提示其保护作用可能与抑制线粒体膜通透性孔道和多种细胞因子有关[8, 10]。CsA具有广泛的药理学活性，同时也是CaN的药理学抑制剂，NFAT则是CaN重要的下游底物。ANT损伤心肌中普遍存在着钙稳态失衡和钙处理障碍，[Ca2+]i持续升高激活CaN的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶活性，使其下游底物NFAT去磷酸化转位进入细胞核，诱导基因转录。CaN、NFAT是氧化应激和细胞凋亡的重要调控因子。CaN、NFAT能调控氧化应激关键酶NADH脱氢酶2/4的转录，通过Fas/FasL途径诱导AIC心肌细胞凋亡[16-17]。本研究中CsA的作用与NFAT抑制剂具有一定程度的重叠：以VIVIT多肽阻断NFAT也能显著提高DNR处理H9c2细胞生存率；先行阻断NFAT再给予CsA，则不能进一步提高细胞生存率。上述结果初步提示CsA的作用还可能与抑制CaN及下游的NFAT有关。因此，CsA对AIC心肌CaN/NFAT的影响及作用十分值得今后深入探索。
综上所述，CsA能抑制ROS生成，增加Bcl-2含量，降低caspase-3活性，减少DNR诱导的H9c2心肌细胞凋亡，减少LDH释放、降低CK含量，改善细胞形态，提高细胞生存率，对DNR处理的H9c2心肌细胞具有一定的保护作用。以上研究进一步揭示了CsA对蒽环类药物心肌损伤的作用，为其在AIC防治中的应用提供了有价值的依据。
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