2. 康立泰药业有限公司，山东 青岛 266112;
3. 山东省药学科学院，山东 济南 250101
2. Kanglitai Pharmaceutical Co., Ltd., Qingdao Shandong 266112, China;
3. Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Jinan 250101, China
2019年12月份以来，由新型冠状病毒-2(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称新冠肺炎)已在全球200多个国家、地区迅速传播，截至2020年12月全世界已累计确诊约6 700万人，导致2.3%的死亡率[1]。基于活检和尸检的研究表明，COVID-19的病理特征表现为严重的肺部炎症、支气管肺泡损伤和淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。除了冠状病毒对呼吸上皮细胞和血管内皮细胞的直接损伤外，这些症状还基于过度的炎症反应。越来越多的证据表明，在SARS-CoV-2感染患者中，过度和异常的宿主细胞因子风暴是导致强烈免疫病理和致命疾病的关键因素[2]。
细胞因子风暴是指一种不受控制的过度炎症反应，局部开始并通过体循环在体内进一步扩散，其形成机制与免疫系统的失调有关。当免疫系统对SARS-CoV-2产生有效的适应性反应时，病毒可被清除，即轻度COVID-19患者可实现自愈。然而，当人类机体不能产生适当的适应性免疫反应时，病毒的持续存在以及随之而来的固有免疫机制的延长和放大，使免疫反应功能失调，从而导致细胞因子风暴的高炎症状态[3]。《柳叶刀》发表的一篇回顾性研究中以武汉大学中南医院41名COVID-19患者为研究对象，发现危重型患者血浆中IL-2、IL-7、IL-10、G-CSF、IP10、MCP-1、TNF-α等均明显升高，证明了SARS-CoV-2感染病人，特别是垂死的病人，血浆中炎症相关细胞因子的浓度显著增加[4]。综上，SARS-CoV-2感染导致了严重的细胞因子风暴，细胞因子风暴的治疗是抢救危重病人的重要环节。
目前还没有针对SARS-CoV-2诱发的细胞因子风暴的特效药。但由于疫情的迫切，已有一些药物被紧急批准用于COVID-19并发细胞因子风暴的治疗[5]。如IL-6受体拮抗剂Tocilizumab、JAK抑制剂Baricitinib、糖皮质激素等。但这些药物均为基于以往的应用经验与作用机制，被紧急批准用于新冠肺炎中抗细胞因子风暴的治疗，而缺乏足够的临床前药效学评价、安全性评价等数据。作为重要的致死因素，细胞因子风暴的临床前研究必不可少，相关的体内外实验也是今后开发新药的必经之路。目前，治疗细胞因子风暴的临床前药效学研究没有统一的标准，缺乏指导依据。本文作者在查阅近年来文献报道后，综述了细胞因子风暴治疗药物的临床前体内外实验，旨在对细胞因子风暴的实验设计方法予以参考指导。
1 抗细胞因子风暴药物动物药效学评价模型的建立与选择 1.1 小鼠模型 1.1.1 病毒诱导的细胞因子风暴模型病毒诱导模型是研究COVID-19最直接、有效的选择，但病毒研究存在一定的危险性，尤其SARS-CoV-2病毒传染性强，对于实验室等级与人员资格都要求极高，所以一定程度上限制了这种模型的选择。目前直接使用SARS-CoV-2感染引起的细胞因子风暴的小鼠体内研究报道较少，因此需参考其他病毒的建模操作方法。为了研究溶瘤病毒治疗引起的细胞因子风暴不良反应机制，任淑琪[6]建立了单纯孢疹病毒I型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)或其基因改造病毒诱导的细胞因子风暴模型。相似的，在研究流感病毒感染期间的细胞因子风暴时，Walsh等[7]利用小鼠肺炎病毒(PVM)菌株经鼻感染；Chen等[8]用小鼠适应株A/PR8病毒经鼻感染。参考上述方法，病毒诱导细胞因子风暴的模型建立方法可通过小鼠滴鼻注入SARS-CoV-2病毒诱导细胞因子风暴模型，或采用以上病毒诱导细胞因子风暴的成熟模型开展研究。
此外，Mahajan等[9]在研究单核/巨噬细胞对细胞因子风暴综合征发育的直接贡献以及参与其激活的信号通路时，利用了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)诱导细胞因子风暴。研究人员给予穿孔素敲除(Prf-/-)小鼠腹腔注射LCMV。穿孔素缺乏小鼠意味着T细胞对病毒的细胞毒性反应缺陷，所以在感染LCMV后，LCMV激发强烈的CD8+ T细胞反应，但T细胞缺陷导致T细胞积累和巨噬细胞活化，从而发展一个有害的过程。这项研究并不针对任何病毒感染，只是单纯模拟细胞因子风暴进行机制研究，所以研究者选择了安全风险较低的LCMV病毒模拟病毒诱发的细胞因子风暴模型。
1.1.2 LPS诱导的细胞因子风暴模型脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，是公认的炎症刺激剂，能够诱导体内促炎因子分泌，同时也是急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的常用造模方法。其造模依据是作为病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)模拟病毒入侵。PAMPs是对于病原微生物表面的一种独特的分子结构的命名，而在人体先天免疫系统的细胞上有识别PAMP的模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)，PRRs对一些病毒、细菌表面的PAMPs进行识别后可激活免疫系统保护[10]。因此LPS模拟SARS-CoV-2 RNA入侵细胞的病理机制，被固有免疫系统识别，激活免疫细胞，在免疫失控时爆发细胞因子风暴。
Su等在寻找潜在的抗COVID-19细胞因子风暴剂时，便利用LPS诱导了小鼠细胞因子风暴模型。小鼠单次腹腔注射LPS即可在血清和支气管肺泡灌洗液中检测到炎性细胞因子水平显著提高，当把LPS剂量提高到致死剂量，可用于检测药物对小鼠生存时间曲线的影响[11]。在《Nature》上发表的一篇关于CAR-T疗法所致细胞因子风暴不良反应的研究中，研究者对BALB/C小鼠腹腔注射LPS以模拟细胞因子风暴的发生[12]。赵晟[13]则提出，LPS的造模方法是模拟细菌感染的过程，他的研究中同样使用腹腔注射的方法给与BALB/C小鼠LPS。文献中一般选择大肠杆菌0111 ∶B4来源的LPS。
1.1.3 TLR激动剂诱导的细胞因子风暴模型与LPS诱导细胞因子风暴模型的原理相似，LPS因被认为是一种PAMPs而用于诱导动物模型，那么Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)则是免疫细胞和包括神经元在内的非免疫细胞表达的主要PRRs之一，如上所述可对入侵机体的病毒、细菌等进行识别，从而激活免疫系统，在细胞因子风暴的产生中起着至关重要的作用。动物模型中使用能过度激活免疫系统的TLRs激动剂，便可使炎性细胞因子大量分泌，造成细胞因子风暴。
Mahajan等[9]基于一些细胞因子风暴综合征患者持续激活TLR信号的临床证据而建立了CpG-1826诱导的小鼠模型，CpG-1826是一种TLR9激动剂，通过反复向野生型小鼠注射CpG，导致炎性细胞因子分泌水平显著提高。这种模型不会导致致命性，细胞因子风暴样的临床特征不能通过T细胞的减少所阻止。在Weaver等[14]的研究中使用了相同的造模方法，他们的研究目的是确定在细胞因子风暴的小鼠模型中，共生微生物区系如何调节TLR驱动的系统免疫反应。
1.1.4 SAgs诱导的细胞因子风暴模型超抗原(SAgs)是由金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌产生的一类强效外毒素，是T细胞的强大激活剂。SAgs可不经过任何处理直接与多肽结合槽外的主要组织相容性复合体Ⅱ(MHC Ⅱ)类分子结合。随后，它们直接与选定的T细胞受体可变区(Vβ或Vα)家族和T细胞上的CD28相互作用，使T细胞受体(TCR)和CD28交联，从而使40%-60%的CD4+和CD8+ T细胞活化。活化T细胞迅速产生大量的促炎细胞因子，导致细胞因子风暴。SAgs还可通过类似的机制激活自然杀伤T细胞(NKT)和粘膜相关不变T细胞(MAITs)等先天T细胞产生细胞因子，从而加重CRS的严重程度[15]。
Kale等[16]在HLA-DR3转基因小鼠中建立了葡萄球菌B型肠毒素(SEB)作为超抗原诱导的细胞因子风暴模型，该模型与人类细胞因子风暴综合征非常相似，以揭示细胞因子风暴的免疫发病机制。在这项研究中，使用HLA-DR3转基因小鼠代替野生型小鼠的原因是细菌SAgs与人MHC(称为HLA)Ⅱ类分子的结合比与小鼠MHC Ⅱ类分子的结合更有效，所以认为在HLA Ⅱ类转基因小鼠中能诱导出与人类更类似的急性细胞因子风暴综合征。
1.2 恒河猴模型恒河猴在基因和生理上与人类相似，在生物医学研究中能够提供更有力的实验证据。Hoang等[17]研究了Baricitinib对感染SARS-CoV-2的恒河猴的气道炎症和中性粒细胞招募的治疗效果。SARS-CoV-2接种到Vero E6细胞上传代产生感染性病毒，印度恒河猴通过鼻内和气管内两种途径感染SARS-CoV-2建立动物模型。《Science》的一篇报道同样以鼻和气管两种感染方式对9只(3组不同剂量)恒河猴接种了SARS-CoV-2[18]。同样来源于《Science》的一篇报道，6只成年中国恒河猴在气管内接种50%组织培养感染剂量的SARS-CoV-2，以研究初次暴露SARS-CoV-2的患者是否有再次感染的风险[19]。
2 抗细胞因子风暴药物体外药效学评价体系细胞因子风暴的发生与体内免疫失调密切相关，当SARS-CoV-2入侵机体后，引发主要由巨噬细胞介导的先天免疫反应，巨噬细胞也会释放IFN和其他促炎因子，继而在适应性免疫中，在MHC Ⅱ的作用下将抗原细胞提呈给CD4+和CD8+ T细胞，促使CD4+ T淋巴细胞分化成致病性Th1细胞，分泌大量炎性细胞因子，最终导致细胞因子风暴的爆发[20]。简言之，免疫细胞收到刺激时打破平衡状态，形成细胞因子风暴。所以在细胞实验中，通常选择免疫细胞作为研究对象。常用的免疫细胞有巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、外周单个核细胞等。
2.1 巨噬细胞巨噬细胞(macrophages)源自单核细胞，在先天免疫反应中发挥重要作用，并将先天免疫反应和获得性免疫反应联系起来，几乎所有的疾病都涉及巨噬细胞功能的加强或抑制，所以它们也是主要的治疗目标[21]。
巨噬细胞系常选择RAW264.7细胞，源自BALB/c小鼠的Abelson白血病病毒转化细胞，是炎性疾病研究中常用的细胞系。RAW264.7细胞可以在LPS、Th1型细胞因子或TLR激动剂等因子的作用下向M1型极化，产生促炎因子，模拟细胞因子风暴的发生过程。Ma等[22]在体外培养的RAW264.7细胞中加入H9N2-Neu病毒或LPS诱导，模拟体外病毒或细菌感染诱导的细胞因子风暴的发生。Arai等[23]在RAW264.7中加入LPS诱导炎性细胞因子的分泌，以此探究抗脓毒症引起的细胞因子风暴的治疗靶点。
另外，还可从小鼠中提取原代巨噬细胞用于体外探究实验，腹腔、脾和骨髓是原代巨噬细胞的常见来源。腹膜提取的原代巨噬细胞是炎性疾病研究中的常用细胞，腹膜腔内存在多种免疫细胞类型，其中巨噬细胞占0.35，仅需向腹膜腔注射冰冻细胞培养液后抽取腹腔液即可获取腹腔巨噬细胞，分离方法简单。Staedtke等[12]在探索CAR-T治疗引起细胞因子风暴发生的机制时，利用了腹膜提取的小鼠原代巨噬细胞进行体外实验；Su等[11]也同样选择用LPS刺激腹膜提取的巨噬细胞，探究候选药物抑制炎性细胞因子释放的机制。脾作为免疫的主要器官，含有大量的免疫细胞，这些细胞很容易以单细胞悬浮液的形式存在，但脾中分离得到的巨噬细胞产率较低，需要通过磁珠分离等技术进行纯化或增加小鼠数量以获得大量的巨噬细胞，因此脾巨噬细胞在相关实验中应用较少。相较于前两种来源，骨髓是当需要获取大量纯化巨噬细胞时的更佳选择。骨髓来源巨噬细胞被Mahajan等[9]用于论证细胞因子综合征中Plcγ2/Tmem178轴的调节作用，另一方面，Karki等[24]在研究COVID-19细胞因子风暴时，用各种细胞因子共同诱导骨髓来源巨噬细胞，从而了解SARS-CoV-2感染过程中释放的促炎细胞因子诱导细胞死亡的能力。
2.2 外周血单个核细胞外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，是人体外周血循环中的重要免疫细胞，PBMC异常是多种炎症性疾病的重要机制。由于在人体内具有数量多、易获取等特点，PBMC不仅是众多疾病发病机制研究的重要对象之一，其比例、数量、功能变化和因子表达等变化也常常被用于炎症、肿瘤等多种疾病的早期诊断和病情监测中[25]。在一项寻找抗COVID-19引起的细胞因子风暴有效药物的研究中，分离了健康志愿者的hPBMC细胞，采用LPS共孵育诱导PBMC细胞产生炎症反应[11]。同样是针对COVID-19的研究，Karki等[24]则是在健康小鼠全血中分离得到了PBMC细胞，感染SARS-CoV-2病毒模拟体外的COVID-19过程。
2.3 淋巴细胞淋巴细胞包括T细胞、B细胞和NK细胞，是特异性免疫反应的核心[26]。脾脏中含有大量的淋巴细胞，是机体重要的免疫器官之一。在动物实验中，由于小鼠血液量少，从血中分离PBMC细胞并不容易，因此通常从小鼠脾脏中提取获得大量的淋巴细胞，用于体外免疫实验。赵晟从小鼠的脾脏中分离出总脾细胞，并进行密度梯度离心提取淋巴细胞，用LPS或TLR7激动剂R848诱导，进行抗细胞因子风暴药物抑制免疫细胞因子的机制研究[13]。Kale等[16]则使用pan-T细胞阴性选择试剂盒进一步分离纯化得到脾T淋巴细胞，在SEB的诱导下检测T细胞活化表型，以此验证细胞因子风暴的发生程度。
3 抗细胞因子风暴药物非临床药效评价指标和参数细胞因子风暴最显著的特征是大量促炎细胞因子水平急剧升高，同时，作为释放这些细胞因子和趋化因子的来源，SARS-CoV-2诱导的先天免疫细胞和适应性免疫细胞的激活也不可忽视，它们直接或间接促进炎症细胞因子的分泌。临床上细胞因子风暴治疗的指导方法就是抑制过多的免疫细胞活化和细胞因子产生。因此，药效学评价时关注促炎细胞因子群和免疫细胞的活化是必要的。此外，研究表明，在重症COVID-19患者中，全身促炎细胞因子增高与肺损伤、多器官功能衰竭及预后不良有直接关系，且不可控的细胞因子信号通路可导致多器官损伤[27]。所以在进行体内实验时，观察肺、肝、肾等主要脏器的病理表现也是非临床药效评价的有效手段。
3.1 炎性标志物细胞因子风暴中表达量升高的主要炎性细胞因子及其功能见Tab 1[28]。
| Inflammatory markers | Function |
| MCP-1 |
MCP-1 is a chemokine which recruits monocytes, memory T cells, and dendritic cells to the sites of inflammation produced by either tissue injury or infection. |
| IL-1 |
Local low concentrations of IL-1 exert immunomodulatory effects, and large amounts of secretion or injection of IL-1 can induce systemic responses through blood circulation. |
| IL-6 |
IL-6 is a typical pro-inflammatory factor causing cytokine storm, which can regulate the response of the acute phase of immune response and hematopoiesis, and plays an important role in the body's anti-infection immune response. |
| IL-17 | In COVID-19, IL-17 is one of the cytokines significantly associated with lung injury, Murray score, and disease severity. |
| TNF-α |
After viral infection, when TNF-α expression is large and uncontrolled, inflammatory mediators are produced in large quantities, leading to the occurrence of “cytokine storm”. |
| IFN-γ |
IFN-γ has complex biological functions, including activation of dendritic cells and macrophages, cytotoxicity of NK cells, and production of antibodies by B lymphocytes |
| IL-10 | IL-10 is a recognized inflammatory and immunosuppressor that may be involved in the prevention of tissue damage. |
| TGF-β | TGF-β plays a role in the differentiation of T cells from primitive T cells to helper T cells. |
| CCL | A subfamily of chemokines, of which proinflammatory effects include: CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, etc. |
| CXCL | A subfamily of chemokines, of which proinflammatory effects include: CXCL-1、CXCL-8、CXCL10, etc. |
炎症标志物的检测一般可通过ELISA、PCR、流式细胞术(FACS)等手段。
3.2 免疫细胞细胞因子风暴引起的ARDS是COVID-19危重病人的主要临床症状，其根本发病原因是肺组织中过度活跃的免疫反应激活并募集大量免疫细胞。所以收集小鼠BALF检测其中免疫细胞的水平是常用的手段。此外，脾作为主要的免疫器官，也存在大量的免疫细胞，同样可取脾组织作为免疫细胞检测的实验对象。目前，常见的免疫细胞检测指标主要有：巨噬细胞(CD11b+，F4/80+)、中性粒细胞(CD11b+，Ly6C-，Ly6G+)、单核细胞(CD11b+，Ly6C+，Ly6G-)、T淋巴细胞(CD4+，CD8+)和B细胞(B220+)。之前的研究已发现CD4+ T细胞(包括Th1、Th2、Th17和Treg)对流感感染的免疫病理和病毒清除都有重要作用，尤其Th1和Th17主要分泌参与炎症的细胞因子，对于细胞因子风暴的形成具有重要调节作用，所以大量报道中均对CD4+ T细胞及其活化细胞进行FACS检测分析[29]。
3.3 并发器官病变《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》中指出了新冠肺炎患者的各个重要器官的病理改变，其大多是细胞因子风暴所致，包括脾脏缩小，白髓萎缩，红髓充血，脾脏内巨噬细胞增生并可见吞噬现象；肝细胞变性，灶性坏死伴中性粒细胞浸润，肝血窦充血，微血栓形成；肾小球毛细血管充血，近端小管上皮变性，肾间质充血，可见微血栓形成等[30]。所以通过对细胞因子风暴中并发器官的组织染色，可以实现针对继发病变治疗作用的观察，或达到证明药物同时具有器官保护的药效作用。
Kale等[16]在针对细胞因子风暴致死的机制研究中，对小鼠的肝、肾、肺和小肠均进行了HE染色实验，观察细胞因子风暴导致的各个器官的病理变化：肺部可见炎症浸润，围绕着气道和血管，充盈肺泡间隙，偶尔出现肺泡间隔模糊；肠结构严重扭曲，包括绒毛严重钝化和(或)丢失，粘膜上皮糜烂至溃烂，坏死，以及明显的中性粒细胞渗入固有层；肾脏和肝脏病理变化不明显。赵晟[13]在Sunitinib抑制免疫细胞因子的药效实验中，验证了Sunitinib对细胞因子风暴小鼠的器官保护作用，研究者剪取小鼠的肝脏与肾脏进行HE染色，细胞因子风暴小鼠的病理表现为肺泡隔和肺间质内有大量的炎性细胞存在，切片表现为肺泡隔增宽，肺间质内大量单核细胞浸润；肾小球萎缩、肾小管肾小球出现充血的特征，具有明显的炎性浸润反应。
4 总结与展望得益于2003年非典防控的经验，我国的医疗防控团队在此次救治COVID-19中有了一些能够借鉴的救治方案，但随着当年SARS病毒传播的突然停止，针对SARS病毒的新药、疫苗开发项目也随之终止了，这也是目前救治COVID-19仍无有效药物的关键原因所在。因此，针对重大流行病相关共性救治环节的新药开发与储备应是我国增强抵御突发重大公共卫生事件能力的重要策略之一[4]。
在“ClinicalTrials.gov”中检索到目前正在进行COVID-19临床实验的研究多达168项，其中与治疗细胞因子风暴相关的药物研究近20项。由于细胞因子风暴的发病机制复杂并涉及免疫系统多个因素的作用，在受试药物作用机制检测以及体内药效学研究方面难度较大。尽管病毒诱导的动物模型能更准确的模拟新冠肺炎并发细胞因子风暴的发病特点，但由于种属相关性、病毒实验危险性以及动物模型本身等限制性因素，直接对实验动物注射病毒进行体内药效学评价存在一定的局限性。而根据以往的研究发现，LPS、TLR激动剂及SAgs同样能够诱导实验动物机体发生细胞因子风暴，这些动物模型为受试药物的初步药效学评价方法提供了更多选择性。
中重度COVID-19患者致死的主要原因就是细胞因子风暴的发生与发展，开发能够减轻细胞因子风暴的药物刻不容缓。本文综述的细胞因子风暴治疗药物的非临床药效学实验方法有：在小鼠上建立病毒诱导、LPS诱导、TLR激动剂诱导及SAgs诱导的细胞因子风暴模型，此外，更贴近人的动物模型还可以选择灵长类动物如恒河猴进行试验。体外模型中可以选择RAW264.7细胞系或小鼠提取的原代巨噬细胞、外周血单个核细胞、淋巴细胞等进行试验，诱导方法一般也是使用LPS或TLR激动剂刺激细胞。药效评价方法为采用ELISA、PCR或FACS等手段检测炎性细胞因子的分泌水平，采用磁珠分选与FACS结合检测相关免疫细胞的数量，取小鼠主要脏器行HE染色观察病理变化。研究者可根据药物预期的治疗效果、作用机制等选择适合的试验方案。对于新冠并发细胞因子风暴症状治疗药物的临床前药效评价，应当在考虑受试药物的作用特点与机制的基础上利用现有的实验方法，尽可能地提供非临床有效性证据，同时，应当兼顾药物的开发风险和医学伦理要求，为临床试验提供支持和参考，降低药物开发的无效性风险。
综上，本文旨在为各类在研抗细胞因子风暴药物的非临床开发提供参考，同时，研究人员也将继续探索新冠肺炎并发细胞因子风暴过程的相关机制，寻找潜在治疗靶点，以进一步推动治疗药物的研发。
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