肝纤维化是一种可逆病变，主要表征为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过度沉积，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)受病毒性肝炎、酒精等因素刺激，由贮存视黄醇的静息态变为激活态，其活化与增殖是肝纤维化形成的主要标志[1]。因此，抑制HSCs活化是逆转肝纤维化的有效途径之一。信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是STAT家族主要成员之一，作为应答IL-6等炎性因子的主要转录因子被首次发现，现被视为慢性炎症形成中不可或缺的关键分子[2]。受异常激活时，STAT3由细胞质转移至细胞核，进而参与细胞增殖、分化、免疫和炎症反应等[3]。白桦酯酸(betulinic acid，BA)，是由白桦树皮中分离获得一种五环三萜类物质，前期研究初步发现，BA可以改善由硫代乙酰胺诱导肝纤维化，但具体作用机制尚不明确[4]。基于STAT3生物学调控作用，本研究探讨BA介导STAT3信号通路改善肝纤维化的影响。
1 材料与方法 1.1 细胞系肝星状细胞系HSCs和巨噬细胞系Raw264.7为韩国生命工学研究院(韩国大田)Jung-Joon Lee博士慷慨相赠。
1.2 药品与试剂白桦酯酸(Skyherb Technologies，98%)；小鼠IL-6 ELISA试剂盒(Neobio Science，42SH01)；ALT(A001)、AST(A002)试剂盒(长春汇力)；苏木精染液(Solarbio，517-28-2)；伊红染色液(BA4024)、Masson(BA4079B)试剂盒(Baso)；DMEM(C11965500BT)、FBS(900-108)、0.25% Try(15090046)购自Gibco BRL；DMSO(D2650)、青霉素/链霉素(I9532、V900929)、LPS(L2880)购自Sigma；Anti-α-SMA(ab5694)、Anti-collagen-1(ab34710)、Anti-MMP-13(ab75606)、Anti-TIMP-1(ab61224)、β-actin(ab8226)购自Abcam；Anti-TLR4(sc-293072)、Anti-p-STAT3(sc-8059)、Anti-STAT3(sc-8019)、Anti-p-LKB1(sc-271924)、Anti-LKB1(sc-374300)、Anti-AMPK(sc-398861)购自Santa Cruz；Anti-p-AMPK(CS-2531)购自Cell Signaling。
1.3 仪器化学成像发光显色仪(Tanon)；共聚焦扫描显微镜(Olympus)；数码倒置显微镜(Nikon)；全自动倒置电泳仪、转印电泳槽、电泳仪、转印电泳槽(Bio-Rad)；水平摇床、低温超速离心机、CO2培养箱(Thermo)；酶标仪(Bio Tek)；净化工作台(上海新范医疗器械有限公司)。
1.4 细胞培养HSCs和Raw264.7细胞分别用含有10% FBS和100 U·L-1的青霉素/链霉素的DMEM培养，在37 ℃、5%的CO2培养箱中进行传代培养。
1.5 ELISA检测上清液IL-6含量Raw264.7细胞接种于6孔板，培养24 h后，给予LPS(1 mg·L-1)孵育细胞不同时间(0、1、3、6、12 h)，收集上清液备用。采用小鼠IL-6 ELISA试剂盒检测上清液中IL-6含量，酶标仪测定波长600 nm处的吸光度值，计算出上述上清液中IL-6含量。
1.6 细胞实验方案Raw264.7细胞接种于6孔板，培养24 h后，给予LPS(1 mg·L-1)孵育12 h，收集上清液备用。为探讨BA对活化HSCs抑制作用的时间和剂量关系，HSCs接种于6孔板，培养24 h后，BA(25 μmol·L-1)预处理HSCs 2h后，给予上述上清液孵育0-6 h；BA(0-25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上述上清液孵育1 h，收集各分组细胞，提取蛋白，-80 ℃备用。
1.7 Western blot实验取-80 ℃中提取的蛋白，并用BCA法测定细胞蛋白浓度，取适量进行Western blot检测，以β-actin为内参，测定蛋白相对表达量。
1.8 动物实验方案C57BL/6雄性小鼠(购于长春亿斯实验动物科技有限公司)，平均体质量(20±2)g。采用标准化饲料喂养小鼠，待小鼠适应喂养1周后，随机分为3组，即：正常组、模型组、BA给药组，每组6只。BA(50 mg·kg-1)灌胃给药4 d后，除正常组外，每组小鼠腹腔注射10% CCl4(2 mL·kg-1)，24 h后，对小鼠进行安乐死，收集血清和肝脏，部分肝脏浸泡于10%福尔马林中，部分冻存于-80 ℃备用。
1.9 ALT、AST指标的测定根据试剂盒说明书检测血清中ALT、AST的水平。
1.10 小鼠肝脏组织病理学观察取固定于10%福尔马林溶液的小鼠肝脏，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。将蜡块厚5 μm切片，经HE、Masson染色和STAT3免疫组织荧光染色后，用共聚焦扫描显微镜进行肝脏组织病理学观察。
1.11 统计分析用Quantityone(Bio-Rad公司)分析X-光片中各条带灰度值进行比较。实验数据用GraphPad Prism 5.0进行统计分析。
2 结果 2.1 LPS对Raw264.7细胞上清液中IL-6含量的影响本研究为模拟体外HSCs所处肝脏炎症微环境，采用LPS刺激Raw264.7细胞获取上清液，再孵育HSCs。由Fig 1可见，随着时间的延长，上清液中IL-6含量逐渐升高，3 h升高具有统计学意义，12 h时达最高值。
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| Fig 1 IL-6 contents in medium of Raw 264.7 *P < 0.05 vs 0 h; ns, no significance. |
由Fig 2可见，BA(25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上清液孵育不同时间，BA可以明显抑制活化HSCs中α-SMA和collagen-I蛋白表达以及TIMP-1/MMP-13比值，呈现时间依赖性。不同浓度BA(0-25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上清液孵育1 h，BA可以明显抑制活化HSCs中α-SMA和collagen-I蛋白表达以及TIMP-1/MMP-13比值，呈现剂量依赖性。
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| Fig 2 Effect of BA on hepatic fibrosis makers in activated HSCs *P < 0.05 vs 0 min, #P < 0.05 vs 10 min; △P < 0.05 vs normal, ▲P < 0.05 vs medium |
由Fig 3可见，BA(25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上清液孵育不同时间，BA可以明显抑制活化HSCs中TLR4和CD14蛋白表达，呈时间依赖性。不同浓度BA(0-25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上清液孵育1 h，BA可以明显抑制活化HSCs中TLR4和CD14蛋白表达，呈剂量依赖性。
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| Fig 3 Effect of BA on TLR4 in activated HSCs #P < 0.05 vs 0 min, *P < 0.05 vs 10 min; △P < 0.05 vs normal, ▲P < 0.05 vs medium |
由Fig 4可见，BA(25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上清液孵育不同时间，BA可以明显增强活化HSCs中STAT3磷酸化蛋白表达。不同浓度BA(0-25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上清液孵育1 h，BA可以明显增强活化HSCs中STAT3磷酸化蛋白表达。
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| Fig 4 Effect of BA on STAT3 in activated HSCs #P < 0.05 vs 0 min, *P < 0.05 vs 10 min; △P < 0.05 vs normal, ▲P < 0.05 vs medium |
由Fig 5可见，BA(25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上清液孵育不同时间，BA可以明显增强活化HSCs中AMPK磷酸化蛋白表达并且明显抑制LKB1磷酸化蛋白表达。不同浓度BA(0-25 μmol·L-1)预处理HSCs 2 h后，给予上清液孵育1 h，BA可以明显增强活化HSCs中AMPK磷酸化蛋白表达并且明显抑制LKB1磷酸化蛋白表达。
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| Fig 5 Effect of BA on AMPK-LKB1 in activated HSCs #P < 0.05 vs 0 min, *P < 0.05 vs 10 min; △P < 0.05 vs normal, ▲P < 0.05 vs medium |
由Fig 6A可见，造模后，模型组小鼠血清中的ALT、AST水平明显高于正常组。给予BA后，给药组小鼠血清中的ALT、AST水平明显降低；由Fig 6B可见，与正常组相比，HE染色显示，模型组有大量炎性细胞浸润到汇管区，Masson染色显示，模型组有大量的胶原纤维增生、交联，形成纤维间隔，STAT3免疫组织荧光染色显示，模型组明显抑制STAT3的阳性表达，给予BA后，给药组小鼠均有明显改善。
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| Fig 6 Effects of BA on related indexes and liver pathological changes in CCl4 induced hepatic fibrosis in mice A: Serum ALT and AST levels, #P < 0.05 vs normal; *P < 0.05 vs CCl4; B: HE, Masson, IHC of STAT3 staining |
肝纤维化发生于各种慢性肝脏疾病中，若治疗不及时可进展为肝硬化甚至肝癌。肝纤维化发生发展中，炎症的控制对疾病的治疗与转归具有关键作用。本研究着眼于调控炎症，结合体内外模拟肝纤维化微环境，研究发现，BA介导STAT3信号通路抑制炎症因子分泌，进而改善肝纤维化。
非特异性免疫和特异性免疫细胞对肝星状细胞产生调控作用。IL-6是非特异性免疫调节作用的细胞因子，在肝脏炎症及肝纤维化中扮演关键作用[5]。本研究利用LPS刺激小鼠巨噬细胞Raw264.7产生相关细胞因子IL-6进行后续实验研究。研究发现，STAT3在肝病的早期阶段表现活跃，该信号通路被IL-6激活后，进而磷酸化的STAT3转移到细胞核，然后激活许多靶基因的转录过程，这些基因在诱导和改善肝纤维化方面非常重要[6]。肝纤维化中STAT3表现出“双刃剑”。有研究发现[7]，STAT3活化能抑制肝纤维化发生，肝细胞特异性STAT3敲除小鼠α-SMA表达明显高于野生型，表明STAT3敲除促进肝纤维化，且STAT3磷酸化上调依赖于Kupffer细胞分泌IL-6。另有研究表明，STAT3抑制剂STX-0119可阻止HSCs活化来抑制肝纤维化的发展[8]。为了进一步探讨STAT3在肝纤维化的作用，研究发现，给予上述上清液后，STAT3磷酸化的表达明显升高，说明BA可能介导STAT3活化来调控肝纤维化。TLR4是巨噬细胞表面的模式识别受体位于HSCs膜上，能促进肝纤维化和炎症的发生。LPS在细胞表面由CD14至TLR4呈递，激活TLR4信号，所以在活化细胞中，TLR4效应蛋白凭借着特异性识别功能，与LPS结合而发生活化[9]。STAT3信号通路能够被TLR4信号通路信号传导产物lL-6激活，具有调节细胞增殖、凋亡以及调控炎性反应等多种过程中，发挥关键作用[10]。在活化的HSCs中，抑制TLR4-STAT3信号，可调控炎症反应，参与肝纤维化调控。AMPK是细胞蛋白质合成的能量调节器，多条信号通路调控其磷酸化，AMPK对调节氧化应激及改善炎症有重要意义，LKB1主要通过调节能量代谢，细胞炎症来抑制癌症发生发展，而LKB1-AMPK信号调控可能是肝损伤改善关键环节之一[11-12]。BA可明显改善CCl4升高的血清转氨酶、组织病理改变，以及STAT3免疫荧光表达。本研究还以LPS刺激Raw264.7细胞，并收集上清液孵育HSCs，模拟体外HSCs所处肝脏炎症微环境。实验结果表明，BA可以抑制活化HSCs中ECM以及炎症因子的表达，从而逆转肝纤维化。BA介导STAT3信号通路，并阻断TLR4信号转导，调控AMPK/LKB1磷酸化，是其改善肝纤维化的潜在机制。
目前临床上肝纤维化治疗以去除病因治疗为主，尚缺乏特异性治疗药物及方法。研发作用靶点明确、安全效优的药物具有重要的临床价值。本研究结果表明，BA介导STAT3信号通路调控TLR4和AMPK/LKB1磷酸化，进而抑制细胞外基质过度沉积和炎症因子分泌，为BA基于STAT3改善肝纤维化提供了新的思路和理论支撑。考虑机体内信号通路庞杂及多样性，仍需要进行更为深入的机制研究。
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