缺血性脑卒中作为严重威胁人类健康的常见病之一，其特点是具有较高的致残率和致死率，一般临床上治疗采取早期溶栓，但其治疗效果仍不理想[1]。炎症是脑缺血主要的发病机理之一，主要涉及外周炎症细胞的浸润、小胶质细胞的活化和炎症介质的过度产生[2]。探索炎症的机制，寻找有效的治疗新靶点，对防治缺血性脑卒中具有重要意义。
炎性细胞，尤其是小胶质细胞，是免疫防御系统抗脑缺血损伤的主要介质。脑缺血后，迅速迁移到损伤部位的小胶质细胞，会启动效应分子的释放和其他免疫细胞的募集[3]。被激活的小胶质细胞主要分为M1和M2两种表型并各自发挥不同的作用，M1型的小胶质细胞通过释放炎性因子，例如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，引发炎症级联反应，加重脑组织损伤[4]。而M2型的小胶质细胞释放抗炎因子转化生长因子-β(transforming growth factor -β，TGF-β)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)以及精氨酸1(arginase-1，Arg-1)等，促进脑组织的修复[5]。因此，将被激活的小胶质细胞从促炎性M1型向抗炎性M2型转变是治疗缺血性脑卒中的一个新思路。
消退素D1(resolvin D1，RvD1)属于一类新的特异性促分解脂质介质，由二十二碳六烯酸衍生而来的代谢产物，并且能够限制中性粒细胞的募集或浸润，抑制炎性因子的产生[6]。甲酰肽受体2(formyl peptide receptor 2，FPR2)也称为甲酰肽样受体1或脂氧素A4受体，是一种G蛋白偶联受体，在抗炎中起重要作用，其广泛分布于大脑中，特别是在小胶质细胞中表达[7]。研究表明，在局灶性脑损伤后RvD1表达减少，其受体FPR2的表达增加，给予RvD1后减少小胶质细胞和星形胶质细胞的激活，减轻炎症损伤，促进功能恢复和神经保护[8]。此外，在脂多糖诱导的大鼠内毒素性葡萄膜炎模型中，RvD1通过调节M1/M2极化减轻炎症反应[9]。然而，目前在脑缺血/再灌注模型中，RvD1调控小胶质细胞M1/M2极化研究较少。因此，本研究探讨RvD1通过FPR2调控小胶质细胞M1/M2极化，从而减轻脑缺血/再灌注后炎症损伤。
1 材料与方法 1.1 动物SPF级SD大鼠，♂，大鼠体质量(250-300) g，广州中医药大学(大学城)实验动物中心购买，合格证号为SCXK(粤)2013-0034。定期给大鼠添加食物和水，保持动物饲养环境温度在20℃-25 ℃，定期给实验室消毒。本研究经广州中医药大学动物伦理委员会批准，符合中国伦理委员会有关动物研究原则。
1.2 试剂FPR2抗体(Novus，NLS1878)；抑制剂Boc-2(Absin，abs4512)；RvD1(Cayman，10012554)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma，T8877)；MPO抗体(Abcam，ab9535)；Iba1兔抗(Wako，019-10741)；Iba-1鼠抗(Santa cruz，sc-32725)；CD206抗体(Santa cruz，sc-70585)；CD16抗体(BD，553141)；RNA快速提取试剂盒(苏州英泽生物医药科技有限公司，B0004DP)；预混型反转录和qPCR试剂盒(广州瑞真生物技术有限公司，AG11706、AG11701)。
1.3 仪器匀浆仪(上海净信实业发展有限公司)；低温高速离心机(力康生物医疗科技控股有限公司)；冰冻切片机(德国Leica公司)；激光共聚焦显微镜(德国ZESS公司)；荧光定量PCR仪(Bio-rad公司)；
1.4 MCAO模型制备根据文献[10]参照改良线栓法，术前禁食12 h左右，麻醉后采用仰卧位去固定大鼠，从颈部的正中线切口，将大鼠右侧颈总动脉，颈外动脉和颈内动脉钝性分离。在近心处的颈外动脉剪V型切口，插入颈内动脉的线栓约为18-20 mm，会感受到稍微的阻力感，说明线栓已插入到中动脉起始处，缺血2 h后，将插入的线栓拔出并用缝合线缝合伤口，24 h后进行下一步操作。Sham组不进行插入线栓的操作。待大鼠清醒后进行神经功能评分，分数在1-3分为造模成功，可纳入实验组，进行下一步实验。
1.5 分组与用药将大鼠随机分为Sham组、MCAO组、RvD1组和RvD1+Boc-2组，每组6只。在线栓阻塞大鼠大脑中动脉后立即腹腔注射RvD1(0.4 μg·kg-1)[8]；在造模前30 min通过腹腔注射给药FPR2拮抗剂Boc-2(0.4 mg·kg-1)[11]。给予术后Sham组和MCAO同等体积生理盐水。
1.6 大鼠脑梗死体积测定脑缺血后24 h，麻醉大鼠并断其颈部取脑，将大脑表面的残留血用PBS溶液洗净，将大鼠大脑放入模具中，冠状位切成厚度为2 mm脑片，共6片，迅速将脑片浸入浓度为2%的TTC溶液中，注意避光，将脑组织放在37 ℃孵育箱10 min，需要5 min翻面一次，白色区域代表梗死，红色区域代表未梗死。并拍照保存，然后分析脑梗死体积使用Image-pro-plus 6.0软件。
1.7 免疫荧光染色脑缺血后24 h，将麻醉的大鼠剪开腹部，暴露心脏，然后用0.9%NaCl溶液进行灌注，最后再用4%多聚甲醛进行固定，取出脑组织进行脱水，按照厚度为10 μm进行切片。具体步骤：先将切片加入Tris缓冲液(TBS)室温浸泡30 min，再分别加入TBS/Triton漂洗10 min×3次，山羊血清封闭2 h后，分别加入稀释后的一抗(FPR2 1 ∶500，鼠抗Iba-1 1 ∶100)，(MPO 1 ∶200)，(CD16 1 ∶200，CD206 1 ∶100，兔抗Iba-1 1 ∶400)；4 ℃孵育过夜，然后将玻片浸泡在TBS溶液10 min，TBS/Triton漂洗10 min×3次，室温避光孵育二抗2 h；用TBS洗10 min×3次，封片，拍片。
1.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)按照RNA快速提取试剂盒提取脑组织的总RNA。采用预混型反转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。根据预混型qPCR试剂盒的说明书进行操作，加入相应的试剂。PCR反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，求同一样本3个复孔的Ct平均值，以GAPDH的Ct值作为内参，并采用2-ΔΔCt方法进行分析。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，序列见Tab 1。
| Gene | Forward primer(5′→3′) | Reverse primer (3′→5′) |
| TNF-α | ATGGGCTCCCTCTCATCAGTTCC | GCTCCTCCGCTTGGTGGTTTG |
| IL-1β | CTCACAGCAGCATCTCGACAAGAG | TCCACGGGCAAGACATAGGTAGC |
| iONS | GAGACGCACAGGCAGAGGTTG | AGCAGGCACACGCAATGATGG |
| TGF-β1 | GACCGCAACAACGCAATCTATGAC | CTGGCACTGCTTCCCGAATGTC |
| IL-10 | CTGCTCTTACTGGCTGGAGTGAAG | TGGGTCTGGCTGACTGGGAAG |
| Arg-1 | AGTGTGGTGCTGGGTGGAGAC | GCGGAGTGTTGATGTCAGTGTGAG |
| GAPDH | GACATGCCGCCTGGAGAAAC | AGCCCAGGATGCCCTTTAGT |
各组数据以x±s表示，并采用SPSS17.0软件，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，用GraphPad Prism 8.0软件作图。
2 结果 2.1 脑缺血后24 h FPR2与Iba-1的共定位如Fig 1所示，结果表明：各组大鼠脑缺血后可见FPR2与不同程度激活的小胶质细胞标记物Iba-1共定位表达。与Sham组比较，MCAO组可见被激活的小胶质细胞上FPR2的荧光表达增强(P < 0.01)；与MCAO组比，RvD1干预后进一步增强被激活的小胶质细胞上FPR2的荧光表达(P < 0.01)；但联合使用Boc-2后被激活的小胶质细胞上FPR2的荧光表达被抑制(P < 0.01)。
|
| Fig 1 Localization of FPR2 and Iba-1 in brain at 24 h post cerebral ischemia(x±s, n=6) A: Double immunofluorescence staining of FPR2(green)and Iba-1(red)in the brain tissues; B: Statistical analysis of FPR2 expression; **P < 0.01 vs sham; ##P < 0.01 vs MCAO; △△P < 0.01 vs RvD1 |
结果表明：与Sham组比，MCAO组的大鼠脑梗死区域增加明显(P < 0.05)；经过RvD1干预后大鼠的脑梗死体积比MCAO组降低(P < 0.05)；与RvD1组比，RvD1与Boc-2联用使大鼠脑梗死体积有增加趋势(P < 0.05), 见Fig 2。
|
| Fig 2 Effect of RvD1 on volume change of cerebral infarction 24 h after cerebral ischemia(x±s, n=6) A: Photographs of brain sections with TTC staining; B: Percentage of cerebral infarct volume. *P < 0.05 vs sham; #P < 0.05 vs MCAO; △P < 0.05 vs RvD1 |
如Fig 3所示，与Sham组比，MCAO组的MPO表达增加(P < 0.05)；与MCAO组比，给予RvD1后MPO表达下降(P < 0.05)；而联合使用Boc-2后逆转了这种效应，且差异具有统计学意义(P < 0.05)。
|
| Fig 3 Effect of RvD1 on MPO expression after cerebral ischemia(x±s, n=6) A: Representative immunofluorescence for MPO in the brain tissues; B: Statistical analysis of MPO expression; *P < 0.05 vs sham; #P < 0.05 vs MCAO; △P < 0.05 vs RvD1 |
如Fig 4所示，与Sham组比，MCAO组CD16+/Iba-1+和CD206+/Iba-1+细胞的数量增加明显(P < 0.01)；与MCAO组比，RvD1组CD16+/Iba-1+细胞数量的表达明显降低(P < 0.01)，而CD206+/Iba-1+细胞数量的表达增加(P < 0.01)；与RvD1组比，RvD1+Boc-2组CD16+/Iba-1+细胞数量的表达有所增加，而CD206+/Iba-1+细胞数量的表达受到抑制，差异有统计学意义(P < 0.01)。
|
| Fig 4 RvD1 facilitates microglial polarization from M1 to M2 after 24 h of cerebral ischemia (x±s, n=6) A: Representative images of CD16(red)/Iba-1(green) immunofluorescence staining; B: Representative images of CD206(red)/Iba-1(green) immunofluorescence staining; **P < 0.01 vs sham; ##P < 0.01 vs MCAO; △△P < 0.01 vs RvD1 |
与Sham组比，MCAO组M1型TNF-α、iNOS、IL-1β和M2型TGF-β1、IL-10、Arg-1 mRNA的表达增加(P < 0.05)；与MCAO组比，RvD1组M1型TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA的表达下降明显，而M2型TGF-β1、IL-10、Arg-1mRNA表达增加更为明显(P < 0.05)；与RvD1组相比，RvD1与Boc-2联合使用后M1型TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA的表达有所增加，而M2型TGF-β1、IL-10、Arg-1 mRNA的表达受到抑制(P < 0.05)，见Fig 5。
|
| Fig 5 Effect of RvD1 on expression of M1/M2 related factors in microglia(x±s, n=6) The mRNA expression level of TNF-α, IL-1β, iNOS, TGF-β1, IL-10, Arg-1; *P < 0.05 vs sham; #P < 0.05 vs MCAO; △P < 0.05 vs RvD1 |
脑缺血的发病机制非常复杂，其中炎症在脑缺血/再灌注损伤中发挥着重要作用。FPR2在脑内小胶质细胞和星形胶质细胞中高度表达[7, 12]，RvD1是由ω-3脂肪酸衍生的内源性脂质分子，以高亲和力激活FPR2并发出促分解反应的信号[13]。RvD1与FPR2结合后可以减轻炎症损伤，但关于RvD1是否可减轻脑缺血后的炎症损伤，目前并没有报道。
我们的实验结果表明，脑缺血后脑组织损伤加重，MPO表达增多，表明大鼠脑缺血后出现炎症反应。具有抗炎作用的FPR2蛋白表达增加有利于减轻炎症反应，提示FPR2在缺血性脑损伤中具有内源性保护作用。另外，本研究发现外源性RvD1进一步增加FPR2的表达，与之类似的是, 有研究报道外源性抗炎脂质介质如脂氧素A4和RvD1可以增加FPR2表达，促使炎症消退并恢复稳态[7, 14]，但具体机制还需日后进一步探讨。我们的实验结果显示，脑缺血后使用RvD1可减少脑梗死体积和MPO表达，同时免疫荧光双染表明FPR2在小胶质细胞中表达，这提示RvD1很可能通过调控小胶质细胞减轻炎症损伤。
小胶质细胞静息状态下为分支状，可有效监测微环境并及时清除凋亡神经元，让大脑处于稳定状态[15]。脑缺血后小胶质细胞迅速被激活，其特征是肥大的形态和增厚的突起，呈阿米巴样，并迁移到损伤部位。其中M1型小胶质细胞分泌大量炎性介质，加剧脑组织损伤，而M2型小胶质细胞通过释放具有修复性的抗炎因子，发挥脑保护作用[5]。肝缺血/再灌注模型中，RvD1已被证实通过FPR2促进小胶质细胞向M2型转化[16]，提示RvD1很可能对缺血性脑卒中后小胶质细胞的极性转换发挥作用。在早期脑损伤模型中，Iba-1阳性细胞数明显增多，M1型炎症因子表达增多，而给予RvD1后M2型抗炎因子增多，炎症因子表达受到抑制[6]。另外，RvD1可促进BV2细胞向M2型转化[17]。本研究将Iba-1分别与M1型标志物CD16、M2型标志物CD206进行免疫荧光双染，发现脑缺血后CD16+/Iba-1+细胞数比CD206+/Iba-1+细胞数增加更为显著，提示脑缺血后小胶质细胞激活向M1型转化。而RvD1治疗后CD16+/Iba-1+细胞数减少和CD206+/Iba-1+细胞数的增加，表明RvD1可促进小胶质细胞向M2型方向极化。RT-qPCR结果进一步显示，RvD1干预后抑制M1型小胶质细胞的炎症介质TNF-α、iNOS、IL-1β mRNA的表达，促进M2型小胶质细胞的抗炎介质Arg-1、IL-10、TGF-β1 mRNA的表达。并且有研究表明，外源性RvD1减少小胶质细胞炎症因子表达，增加抗炎因子表达，且基因水平和蛋白水平表达一致[6]。上述结果提示RvD1干预后促进小胶质细胞从M1表型向M2表型极化，从而减轻炎症损伤。
此外，在肝缺血模型中使用拮抗剂Boc-2会降低FPR2表达，进而抑制RvD1对小胶质细胞M2极化的作用[16]。为了进一步探讨FPR2在RvD1促进小胶质细胞M1/M2极化中的作用，本研究采用FPR2拮抗剂Boc-2与RvD1联合给药进行干预，发现M1型标记物和炎性介质表达有增加的趋势，而M2型标记物和抗炎因子的表达都受到抑制，这说明Boc-2阻断FPR2的作用，使RvD1对大鼠脑缺血损伤的保护作用受到抑制。这些结果表明RvD1促进小胶质细胞M1/M2极化是通过激活FPR2实现的。
综上所述，RvD1通过激活FPR2促进小胶质细胞从M1型向M2型转化，减轻大鼠脑缺血/再灌注后的炎症损伤，从而发挥脑的保护作用。
( 本实验在广州中医药大学中西医结合基础研究中心完成，感谢所有老师及同学们的支持与帮助! )
| [1] |
余萍萍, 王莉, 唐凡人, 等. 白藜芦醇对大鼠脑缺血/再灌注损伤后星形胶质细胞活化的影响[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(9): 1228-33. Yu P P, Wang L, Tang F R, et al. Effects of resveratrol on astrocyte activation aftercerebral ischemia /reperfusion injury in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(9): 1228-33. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.09.010 |
| [2] |
Wu R, Li X, Xu P, et al. TREM2 protects against cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Mol Brain, 2017, 10(1): 2. doi:10.1186/s13041-016-0282-7 |
| [3] |
Zhou S, Zhu W, Zhang Y, Pan S, Bao J. S100B promotes microglia M1 polarization and migration to aggravate cerebral ischemia[J]. Inflamm Res, 2018, 67(11-12): 937-49. doi:10.1007/s00011-018-1187-y |
| [4] |
甘海燕, 李琳, 杨琰, 等. 补阳还五汤调控小胶质细胞/巨噬细胞极化抑制大鼠脑缺血后炎症反应研究[J]. 浙江中医药大学学报, 2019, 43(1): 1-6. Gan H Y, Li L, Yang Y, et al. Buyang Huanwu Decoction inhibits inflammation via regulating microglia/macrophage polarization after cerebral ischemia in rats[J]. J Zhejiang Chin Med Univ, 2019, 43(1): 1-6. |
| [5] |
朱婷, 孙桂波, 孟祥宝, 等. 小胶质细胞/巨噬细胞的极化及在脑卒中修复中的作用[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(8): 1046-50. Zhu T, Sun G B, Meng X B, et al. Role of sphingosine-1-phosphate and its signaling pathway in inflammation-related diseases[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(8): 1046-50. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2019.08.003 |
| [6] |
Liu G J, Tao T, Wang H, et al. Functions of resolvin D1-ALX/FPR2 receptor interaction in the hemoglobin induced microglial inflammatory response and neuronal injury[J]. J Neuroinflammation, 2020, 17(1): 239. doi:10.1186/s12974-020-01918-x |
| [7] |
Liu W, Huang J, Doycheva D, et al. RvD1 binding with FPR2 attenuates inflammation via Rac1/NOX2 pathway after neonatal hypoxic-ischemic injury in rats[J]. Exp Neurol, 2019, 320: 112982. doi:10.1016/j.expneurol.2019.112982 |
| [8] |
Bisicchia E, Sasso V, Catanzaro G, et al. Resolvin D1 halts remote neuroinflammation and improves functional recovery after focal brain damage via ALX/FPR2 receptor regulated microRNAs[J]. Mol Neurobiol, 2018, 55(8): 6894-905. doi:10.1007/s12035-018-0889-z |
| [9] |
Rossi S, Di Filippo C, Gesualdo C, et al. Protection from endotoxic uveitis by intravitreal Resolvin D1: involvement of lymphocytes, miRNAs, ubiquitin proteasome, and M1/M2 macrophages[J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015: 149381. |
| [10] |
Longa E Z, Weinstein P R, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989, 20(1): 84-91. |
| [11] |
Rossi S, Di Filippo C, Gesualdo C, et al. Interplay between intravitreal RvD1 and local endogenous sirtuin-1 in the protection from endotoxin-induced uveitis in rats[J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015: 126408. |
| [12] |
He H Q, Ye R D. The formyl peptide receptors: Diversity of ligands and mechanism for recognition[J]. Molecules, 2017, 22(3): 455. doi:10.3390/molecules22030455 |
| [13] |
Luan H, Wang C, Sun J, et al. Resolvin D1 protects against ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury by increasing Treg percentages via the ALX/FPR2 pathway[J]. Front Physiol, 2020, 11: 285. doi:10.3389/fphys.2020.00285 |
| [14] |
Alessi M C, Cenac N, Si-Tahar M, Riteau B. FPR2: Anovel promising target for the treatment of influenza[J]. Front Microbiol, 2017, 8: 1719. doi:10.3389/fmicb.2017.01719 |
| [15] |
Li F, Zhao H, Han Z, et al. Xuesaitong may protect against ischemic stroke by modulating microglial phenotypes and inhibiting neuronal cell apoptosis via the STAT3 signaling pathway[J]. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2019, 18(2): 115-23. doi:10.2174/1871527317666181114140340 |
| [16] |
Kang J W, Lee S M. Resolvin D1 protects the liver from ischemia/reperfusion injury by enhancing M2 macrophage polarization and efferocytosis[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, 1861(9 Pt A): 1025-35. |
| [17] |
Li L, Wu Y, Wang Y, et al. Resolvin D1 promotes the interleukin-4-induced alternative activation in BV-2 microglial cells[J]. J Neuroinflammation, 2014, 11: 72. doi:10.1186/1742-2094-11-72 |