2. 广州中医药大学第二附属医院 珠海医院，广东 广州 510120;
3. 广州中医药大学第二附属医院 广东省中医证候临床研究重点实验室，广东 广州 510120
2. Zhuhai Hospital, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China;
3. Guangdong Provincial Key Lab of Clinical Research on Traditional ChineseMedicine Syndrome, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China
知母-黄柏药对最早出自金·李杲《兰室秘藏》，是用于治疗糖尿病的经典药对[1]。黄柏为芸香科植物黄皮树(Phellodendron chinense Schneid)的干燥树皮，习称“川黄柏”，具有抗菌、抗氧化和降糖等作用[2]。知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge)的干燥根茎，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化和降血糖等作用[3]。
知母的主要有效成分之一芒果苷，是一种具有C-糖苷和氧杂蒽酮成分的天然化合物，具有多种药理活性，如降血糖[4]、调节脂代谢[5]，抗氧化[6]，提高线粒体生物能量[7]等。我们研究发现[8-9]，知母配伍黄柏给大鼠用药后，芒果苷血药浓度明显低于单用知母，而在胰腺组织中药物浓度却显著升高。选择大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞进行芒果苷单体的细胞药代动力学研究[10]，发现芒果苷的Cmax和AUC(0-t)随剂量增大而增加，在细胞被氧化损伤后明显降低。然而知母黄柏配伍对芒果苷在细胞内含量的影响，以及芒果苷进入细胞后如何分布尚不清楚。因此本研究继续选择INS-1细胞，进一步考察配伍对芒果苷在INS-1细胞药代动力学特征的影响；以及相同剂量的芒果苷在正常和氧化损伤的INS-1细胞内的分布变化，为进一步解释芒果苷的药理作用提供实验依据。
1 材料 1.1 主要药品与试剂芒果苷对照品(批号：111607-200301，纯度HPLC>98%)，中国药品生物制品检定所；芦丁对照品(批号：O0714AS，纯度HPLC>98%)，大连美仑生物技术有限公司；细胞核/线粒体分离试剂盒(批号：20190516，江苏凯基生物有限公司)；PBS缓冲液，美国Hyclone公司；过氧化氢(H2O2)、噻唑蓝(MTT)粉末、二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司；RPMI 1640培养基、青/链霉素溶液(双抗)、南美胎牛血清、0.25%胰酶均来自美国Gibco公司；冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；知母(批号：170408241，产地河北)、黄柏(批号：170500301，产地四川)，广东康美药业股份有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物技术公司；甲醇、乙腈(美国默克公司)均为HPLC色谱纯；水为Milli-Q超纯水。
1.2 主要仪器QTRAP 6500+型液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)，配备SHIMADZU LC-30AD高效液相色谱(日本岛津公司)、Turbo Ionspray离子源(ESI)及Analyst 1.7数据处理系统(美国AB Sciex公司)；Sonics VCS 105型超声波细胞破碎仪(美国Sonics公司)；真空冷冻干燥仪(Christ Alpha2-4LSC-Plus，德国Christ公司)；5430R高速台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；VICTOR X5酶标仪(美国PerkinElmer公司)；BF2000-30A氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)；Allegra X-22R型多功能台式冷冻离心机、Microfuge 16型台式微量离心机(美国Beckman Coulter公司)；AB135-S型十万分一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。
1.3 实验细胞INS-1细胞为大鼠胰岛素瘤细胞，购于北京北纳生物科技有限公司。
2 方法 2.1 溶液制备 2.1.1 知母-黄柏药液将药材粉碎至适当细度过筛，知母黄柏各45.0 g(1 ∶1)，加纯水至360 mL，浸泡30 min后，回流装置煎1 h，过滤收集药液，提取两次，合并两次药液后浓缩至90 mL，置于-80 ℃冰箱预冷后冷冻干燥48 h，得到知母-黄柏药对冻干粉(含芒果苷14.0 mg·g-1)，密封于4 ℃冰箱保存备用；用时采用完全培养基溶解并稀释至所需浓度。
2.1.2 知母药液将药材粉碎至适当细度过筛，称量知母45.0 g，其他处理同“2.1.1”，最终得到知母冻干粉(含芒果苷21.8 mg·g-1)，4 ℃冰箱密封保存；用时采用完全培养基溶解并稀释至所需浓度。
2.1.3 芒果苷精密称取芒果苷42.23 mg溶于0.5 mL DMSO中，吹匀使其完全溶解，得到浓度为200 mmol·L-1的芒果苷母液，保存于-20 ℃冰箱；用前采用完全培养基稀释至所需浓度。
2.2 不同给药方式的芒果苷细胞药代动力学实验 2.2.1 细胞给药与收集将生长至对数期的细胞，种于24孔板，每组每个时间点设6孔，每孔约1.0×105个细胞，孵育24 h后，芒果苷单体、知母、知母-黄柏药对分别给药(剂量以芒果苷计为7 mg·L-1)，给药前取空白细胞，给药后分别在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h收集细胞，PBS缓冲液清洗3遍后，加入120 μL灭菌超纯水，反复冻融3遍后超声裂解细胞，-80 ℃保存。
2.2.2 细胞样本处理取出冻存的样品于冰面解冻，4 ℃，12 000 r·min-1，离心15 min。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明操作，测定蛋白浓度，然后固定蛋白量至5 g·L-1。取100 μL固定蛋白量的细胞裂解样品，加入内标芦丁(218 μg·L-1)10 μL，混匀后加入400 μL乙腈∶乙酸(V/V 40 ∶1)，振荡3 min，14 800 r·min-1离心10 min，取400 μL上清N2吹干，残渣加200 μL 40%甲醇复溶，振荡3 min，14 800 r·min-1离心10 min，取上清过膜，进行LC-MS/MS分析。
2.3 芒果苷在INS-1细胞内的分布实验 2.3.1 细胞样品采集将生长至对数期细胞种于15 cm培养皿中，每孔约5.0×106个细胞，设置对照组和模型组，每组每个时间点设6皿，孵育24 h后模型组加入10 mL 140 μmol·L-1 H2O2进行氧化损伤造模，对照组加入等体积全培。造模1 h后，吸取上清丢弃，均给药10 mL 100 μmol·L-1芒果苷，给药前取空白细胞，给药后分别在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48 h收集细胞，PBS缓冲液清洗3遍后，加入1.5 mL预冷的Lysis Buffer，刮下细胞，将细胞悬液反复冻融3遍后超声裂解细胞，于-80 ℃保存。
2.3.2 细胞核/线粒体的提取处理将细胞悬液取出于冰面上解冻，按照细胞核/线粒体分离试剂盒操作说明，分离细胞核、线粒体和胞质，于-80 ℃保存。用时取出冰上溶解，处理方法同“2.2.2”。
2.4 细胞药物浓度测定采用已建立的LC-MS/MS方法[10]测定样品的芒果苷浓度。以芦丁为内标，色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm)；流动相为1%冰乙酸(A)-甲醇(B)；梯度洗脱条件为0~2.0 min：20% B；2.0~4.0 min：20%~70% B；4.0~4.5 min：70%~20% B；4.5~7.0 min：20% B，流速0.3 mL·min-1。检测方式为正离子多离子反应监测(MRM)，用于定量分析的离子对分别为：m/z 423.0→273.2(芒果苷)；m/z 611.5→303.0(内标芦丁)。
经方法学考察，细胞内源性物质不会干扰MGF和内标的测定；MGF在2~500 μg·L-1内，线性关系良好(r=0.996 5)，定量下限为2 μg·L-1；定量下限、低、中、高4个浓度MGF质控样品日内RSD均≤9.40%，日间RSD均≤14.49%，提取回收率均≥86.32%，准确度在93.97%~103.54%，均符合生物样品药物浓度测定方法学要求。MGF浓度根据随行标准曲线计算，并随行低、中、高3个浓度的质控样品。
2.5 数据处理与统计分析采用DAS 2.0软件根据非房室模型进行数据处理，计算出各药物代谢动力学参数Cmax、Tmax、AUC、T1/2等，其中Tmax和Cmax为实测值，AUC用梯形法计算。用SPSS 22.0进行统计学分析，以t检验比较两组间差异，单因素方差分析法进行多组间比较。
3 结果 3.1 配伍对芒果苷细胞药代动力学的影响 3.1.1 芒果苷单体、知母、知母-黄柏药对给药后芒果苷的药时曲线INS-1细胞单次给药芒果苷单体(mangiferin，MGF)、知母(Zhimu，ZM)、知母-黄柏药对(Zhimu-Huangbai herb pair，ZB)后，芒果苷均较快进入细胞，并出现多个峰，约在4-6 h达到浓度峰值。从细胞内平均药物浓度-时间曲线(Fig 1)可见，芒果苷单体组浓度最低，知母组次之，药对组浓度最高，配伍黄柏使知母中芒果苷细胞内浓度明显升高。
|
| Fig 1 Mean drug concentration-time curvesof mangiferin after single administration of mangiferin, Zhimu and Zhimu-Huangbai in INS-1 cells(n=6) |
INS-1细胞单次给药芒果苷单体、知母、知母-黄柏药对后芒果苷的药动学参数见Tab 1。单次给药INS-1细胞芒果苷单体后，细胞内芒果苷Cmax较低；给药知母后，芒果苷Cmax和AUC(0-t)比单体组升高，但差异均无统计学意义。药对给药后，平均驻留时间MRT(0-t)和T1/2基本不变；Cmax比知母组升高，且高于单体组(P < 0.01)；AUC(0-t)则明显高于单体组和知母组(P < 0.01)，提示配伍黄柏对知母有效成分芒果苷进入INS-1细胞具有一定的促进作用。
| Parameter | MGF | ZM | ZB |
| Cmax/μg·L-1 | 16.06±4.86 | 25.57±6.48 | 30.12±7.64** |
| Tmax/h | 7.33±2.42 | 4.67±1.03 | 8.00±3.10 |
 |
6.26±2.54 | 5.89±2.16 | 6.68±2.38 |
| AUC(0-t)/μg·h·L-1 | 200.34±57.99 | 293.00±96.68 | 480.69±74.69**## |
| AUC(0-∞)/μg·h·L-1 | 251.82±139.47 | 322.14±113.98 | 541.17±127.77** |
| Vz/F/mL·kg-1 | 762.33±210.31 | 537.73±156.25 | 348.45±46.81* |
| CLz/F/mL·h·kg-1 | 94.48±33.99 | 67.70±19.75* | 38.75±9.24 |
| MRT(0-t)/h | 9.72±1.69 | 9.07±0.66 | 9.52±0.49 |
| MRT(0-∞)/h | 13.29±5.48 | 11.66±2.22 | 12.00±2.52 |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs MGF; ##P < 0.01 vs ZM | |||
芒果苷在正常组和氧化损伤组INS-1细胞中细胞质、细胞核、线粒体的平均药-时曲线如Fig 2所示。正常组INS-1细胞单次给药芒果苷100 μmol·L-1后，芒果苷在细胞质中浓度快速上升，且明显高于细胞核和线粒体，达峰后浓度开始下降，4 h达到Cmax，在线粒体的浓度最低，且浓度基本维持不变，在细胞核中达峰较慢，药时曲线呈持续上升趋势；而在模型组中，细胞质中浓度上升较快，线粒体的浓度仍然最低，在细胞核中达峰时间提前，约在7 h达到Cmax，随后浓度下降。
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| Fig 2 Mean drug concentration-time curves of mangiferin after single administration of 100 μmol·L-1 mangiferin in mitochondria, nuclei and cytosol in normal(CON) and model(MOD) INS-1 cells |
正常组和模型组INS-1细胞单次给药芒果苷单体100 μmol·L-1后，芒果苷在细胞的线粒体、细胞核、细胞质内的药代动力学参数见Tab 2。正常组INS-1细胞单次给药芒果苷100 μmol·L-1后，芒果苷在细胞内分布Cmax和AUC(0-t)从小到大的顺序为：线粒体＜细胞质＜细胞核，在模型组细胞顺序为：线粒体＜细胞核＜细胞质，提示在正常组芒果苷主要分布于细胞核，而在模型组主要分布于细胞质。
| Parameter | Mitochondria | Nuclei | Cytosol | |||||
| CON | MOD | CON | MOD | CON | MOD | |||
| Cmax/μg·L-1 | 3.76±0.40 | 31.65±4.51** | 133.98±35.12 | 68.13±21.68** | 126.83±17.82 | 180.83±85.27* | ||
| Tmax/h | 24.42±25.84 | 8.00±2.19 | 48.00±0.00 | 7.00±2.44** | 4.00±0.00 | 6.33±4.93 | ||
 |
146.45±41.19 | 19.79±14.81* | 16.38±3.63 | 11.05±4.69 | 28.64±5.97 | 19.30±11.34 | ||
| AUC(0-t)/μg·h·L-1 | 163.81±12.55 | 674.35±162.82** | 2 905.62±533.23 | 1 341.83±45.00** | 2 268.21±110.23 | 3 622.43±794.69** | ||
| AUC(0-∞)/μg·h·L-1 | 946.65±173.85 | 1 845.61±1 386.47 | 5 906.96±735.46 | 1 473.68±186.52** | 3 529.03±333.15 | 4 628.85±1 168.69 | ||
| Vz/F/mL·kg-1 | 22 094.91±2 782.04 | 4 50.63±1 884.33** | 415.25±148.46 | 1 053.52±293.96** | 1 162.35±157.78 | 590.20±272.49** | ||
| CLz/F/mL·h·kg-1 | 108.69±20.27 | 47.20±16.35 | 17.17±2.34 | 68.65±7.56** | 28.54±2.64 | 22.84±6.16 | ||
| MRT(0-t)/h | 24.88±0.78 | 20.99±2.45** | 34.11±1.93 | 19.76±0.54** | 21.16±0.78 | 17.08±3.03* | ||
| MRT(0-∞)/h | 219.17±56.75 | 98.76±81.76* | 53.66±3.17 | 32.36±4.45** | 45.48±8.23 | 31.57±15.83 | ||
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs CON | ||||||||
与正常组相比，芒果苷在模型组INS-1细胞线粒体中AUC(0-t)、Cmax显著升高(P < 0.01)，T12、MRT(0-t)明显降低(P < 0.05)，表明进入线粒体中的芒果苷含量增加，消除较快；在模型组细胞核中Cmax、AUC(0-t)、MRT(0-t)，明显降低(P < 0.01)，表明芒果苷在模型组细胞核中含量减少且消除较快；Tmax显著减小(P < 0.01)，提示进入细胞核中的芒果苷达峰时间提前；胞质中Cmax和AUC(0-t)明显增加(P < 0.05)，提示氧化损伤状态下更多药物进入细胞质；MRT(0-t)则降低(P < 0.01)，表明芒果苷在模型组细胞质中消除较快；T12亦呈现下降的趋势。
4 讨论本文通过LC-MS/MS考察了配伍黄柏对知母中芒果苷在INS-1细胞的药代动力学特征的影响。在确定给药剂量时我们发现，知母冻干粉在25~2 000 mg·L-1剂量范围内对INS-1细胞均无明显毒性作用，而药对冻干粉在2 000 mg·L-1时对细胞产生了明显的毒性作用，经综合考虑细胞毒性和检测灵敏度等因素，最终使用500 mg·L-1知母-黄柏药对进行试验，其所含芒果苷为7 mg·L-1，以芒果苷7 mg·L-1作为给药剂量确定芒果苷单体及知母冻干粉的用量。从结果来看，芒果苷单体给药虽然吸收较快，但浓度较低；知母单独给药后，芒果苷在细胞内浓度Cmax和AUC(0-t)分别上升了59.22%和46.25%，说明知母中的某些成分促进了芒果苷在INS-1细胞中的吸收。Tian等[11]研究发现，芒果苷与知母皂苷B2联合给药和知母汤给药均可明显促进芒果苷的吸收，且效果相当，提示知母皂苷B2可能是促进细胞内芒果苷含量上升的主要活性成分之一。配伍黄柏后，T1/2没有显著性变化，提示知母配伍黄柏后对芒果苷在细胞内的消除影响不大，但Cmax和AUC(0-t)较知母组分别上升了17.79%和64.06%，较芒果苷单体组分别上升了87.55%和139.94%，表明黄柏中活性成分在一定程度上促进了INS-1细胞对芒果苷的吸收。黄柏的化学成分复杂多样[2]，包括酚酸类、黄酮类和生物碱等，其中生物碱是主要有效成分，如小檗碱、药根碱、木兰花碱、黄柏碱等。有研究表明[12-13]，小檗碱能明显提高GK大鼠血浆和肝脏中知母皂苷B2的水平，还能提高木兰花碱的生物利用度且效果与黄柏水煎液相当。但小檗碱是否能促进芒果苷的吸收尚不清楚，黄柏中能够明显升高芒果苷在INS-1细胞中浓度的有效成分尚不明确，值得进一步探讨。
芒果苷是知母中重要的降糖活性成分之一，细胞中芒果苷浓度的增加更有利于知母黄柏药对降糖作用的发挥。对芒果苷在INS-1细胞内的分布研究发现，芒果苷在正常INS-1细胞中主要分布于胞核，而在氧化损伤状态下较多分布于胞质。其在线粒体中也发生了明显的改变，在氧化损伤状态的INS-1细胞中，线粒体AUC(0-t)、Cmax较正常组分别增加了4.11、8.41倍。推测这些分布变化可能与芒果苷的抗氧化作用有关。胞质中存在多种细胞器，其中内质网是动物细胞内面积最大的细胞器。药效研究表明，芒果苷通过调节AMPK活性来抑制内质网应激(ER stress)相关的NLRP3炎性小体在PVAT中的活化，从而改善内皮细胞的胰岛素抵抗[14]；也可有效抑制高糖诱导的内质网应激相关的氧化应激，并通过抑制TXNIP/NLRP3炎性小体的激活和恢复线粒体膜电位，减少细胞凋亡来保护细胞[15]；还可以清除线粒体产生的活性氧，恢复线粒体生物能量从而有效保护细胞[7]；增加葡萄糖的氧化，提高ATP的生成和维持线粒体膜电位[16]；提示胞质和线粒体是芒果苷发挥作用的重要部位和靶点。我们的研究表明，当细胞发生氧化损伤时，芒果苷更大量的进入细胞质和线粒体，这也为证实芒果苷的作用部位，解释芒果苷的作用及机制提供了重要依据。
| [1] |
丁元庆. 《兰室秘藏》应用知母-黄柏之浅识[J]. 中医函授通讯, 1995, 13(2): 14-5. Ding Y Q. Discussion of application of Zhimu-Huangbai in secret book of orchid chamber[J]. Chin Archives Tradit Chin Med, 1995, 13(2): 14-5. |
| [2] |
高妍, 周海芳, 刘朵, 等. 黄柏化学成分分析及其药理作用研究进展[J]. 亚太传统医药, 2019, 15(4): 207-9. Gao Y, Zhou H F, Liu D, et al. Chemical composition analysis and pharmacological research progress of cortex pheiiodendri[J]. Asia Pac Tradit Med, 2019, 15(4): 207-9. |
| [3] |
冯菲. 知母的药理作用研究进展[J]. 中医临床研究, 2017, 9(12): 133-7. doi:10.3969/j.issn.1674-7860.2017.12.063 |
| [4] |
Gu W W. Review of mangiferin in the treatment of type 2 diabetes[J]. J Chin Rx Drug, 2020, 18(6): 17-20. |
| [5] |
Zhang Q, Kong X, Yuan H, et al. Mangiferin improved palmitate-induced-insulin resistance by promoting free fatty acid metabolism in HepG2 and C2C12 cells via PPARα: mangiferin improved insulin resistance[J]. J Diabeters Res, 2019, 2019: 2052675. |
| [6] |
Ding L Z, Teng X, Zhang Z B, et al. Mangiferin inhibits apoptosis and oxidative stress via BMP2/Smad-1 signaling in dexamethasone-induced MC3T3-E1 cells[J]. Int J Mol Med, 2018, 41(5): 2517-26. |
| [7] |
Alberdi E, Sanchez-Gomez M V, Ruiz A, et al. Mangiferin and morin attenuate oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and neurocytotoxicity, induced by amyloid beta oligomers[J]. Oxid Med Cell Longev, 2018, 2018: 2856063. |
| [8] |
Liu Y, Xu F, Zeng X, et al. Application of a liquid chromatography/tandem mass spectrometry method to pharmacokinetic study of mangiferin in rats[J]. J Chromatogr B, 2010, 878(32): 3345-50. doi:10.1016/j.jchromb.2010.10.014 |
| [9] |
Lin A, Li J, Li D, et al. Tissue distribution study of mangiferin after intragastric administration of mangiferin monomer, Rhizoma Anemarrhenae, and Rhizoma Anemarrhenae-Phellodendron decoctions in normal or type 2 diabetic rats by LC-MS/MS[J]. J Chromatogr B, 2019, 1122-1123: 18-28. doi:10.1016/j.jchromb.2019.05.019 |
| [10] |
周鸿, 郑丽婷, 林爱华, 等. LC-MS/MS法测定芒果苷在INS-1细胞中药代动力学[J]. 中国药理学通报, 2020, 36(7): 1024-9. Zhou H, Zheng L T, Lin A H, et al. Pharmacokinetics of mangiferin in INS-1 cells determined by LC-MS/MS[J]. Chin Pharmacol Bull, 2020, 36(7): 1024-9. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2020.07.024 |
| [11] |
Tian X, Xu Z, Li Z, et al. Pharmacokinetics of mangiferin and its metabolite-norathyriol, Part 2: Influence of UGT, CYP450, P-gp, and enterobacteria and the potential interaction in Rhizoma Anemarrhenae decoction with timosaponin B2 as the major contributor[J]. Biofactor, 2016, 42(5): 545-55. doi:10.1002/biof.1290 |
| [12] |
Tian X, Liu F, Li Z, et al. Enhanced anti-diabetic effect of berberine combined with timosaponin B2 in Goto-Kakizaki rats, associated with increased variety and exposure of effective substances through intestinal absorption[J]. Front Pharmacol, 2019, 10: 19. doi:10.3389/fphar.2019.00019 |
| [13] |
Tian X, Li Z, Lin Y, et al. Study on the PK profiles of magnoflorine and its potential interaction in cortex phellodendri decoction by LC-MS/MS[J]. Anal Bioanal Chem, 2014, 406(3): 841-9. doi:10.1007/s00216-013-7530-9 |
| [14] |
Xu X, Chen Y, Song J, et al. Mangiferin suppresses endoplasmic reticulum stress in perivascular adipose tissue and prevents insulin resistance in the endothelium[J]. Eur J Nutr, 2018, 57(4): 1563-75. doi:10.1007/s00394-017-1441-z |
| [15] |
Song J, Li J, Hou F, et al. Mangiferin inhibits endoplasmic reticulum stress-associated thioredoxin-interacting protein/NLRP3 inflammasome activation with regulation of AMPK in endothelial cells[J]. Metabolism, 2015, 64(3): 428-37. doi:10.1016/j.metabol.2014.11.008 |
| [16] |
Apontes P, Liu Z, Su K, et al. Mangiferin stimulates carbohydrate oxidation and protects against metabolic disorders induced by high-fat diets[J]. Diabetes, 2014, 63(11): 3626-36. doi:10.2337/db14-0006 |