2. 甘肃省武威市第二人民医院，甘肃 武威 733000;
3. 湖北民族大学附属民大医院风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000
2. the Second People's Hospital of Wuwei, Wuwei Gansu 733000, China;
3. Hubei Provincial Key Lab of Occurrence and Intervention of Rheumatic Diseases, the Affiliated Hospital of Hubei University for Nationalities, Enshi Hubei 445000, China
乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤，其中三阴性乳腺癌约占乳腺癌发病总数的15%-20%，其具有易转移、复发和死亡率高的特征[1]。三阴性乳腺癌由于低表达或不表达雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体-2，其对内分泌治疗不敏感，因而缺乏有效的临床治疗手段。因此，探索和发现针对三阴性乳腺癌的临床药物靶点和治疗策略具有重要的临床意义。
赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine specific demethylase1，LSD1)是一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性的去甲基化酶，主要催化二甲基化和单甲基化的组蛋白H3K4发生去甲基化，由此参与染色质重塑和基因表达调控，在胚胎发育、细胞分化和肿瘤发生等重要生理病理过程中发挥重要作用。研究发现，LSD1异常高表达可促进包括乳腺癌在内的多种肿瘤发生、发展[2-4]，LSD1的异常高表达一方面促进乳腺癌细胞恶性增殖，另一方面，还以LSD1-Snail蛋白复合物形式在上皮标志物E-cadherin基因启动子区发挥抑制功能，从而沉默其基因转录，由此导致上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)发生，促进乳腺癌细胞迁移[5-6]。
既有研究发现，临床降血压药物优降宁(Pargyline)具有单胺氧化酶(MAO)抑制作用，可有效抑制LSD1的酶活性[7-8]，因而已被用于以LSD1为靶点的抗肿瘤研究，有望成为肿瘤表观遗传治疗领域的潜在抗癌药物[9]。多柔比星(Doxorubicin，DOX)是临床一线肿瘤化疗药物，目前被广泛用于乳腺癌的治疗。多柔比星可通过嵌入DNA双螺旋结构，从而破坏拓扑异构酶Ⅱ介导的DNA修复，通过抑制DNA复制诱导细胞凋亡发生，继而发挥抗肿瘤细胞增殖的作用。此外，也有研究报道，多柔比星可以通过非拓扑异构酶Ⅱ依赖的机制诱导细胞凋亡[10]。尽管多柔比星具有出色的抗肿瘤活性，但其治疗指数相对较低，并且药物毒性较大，因此限制了临床应用。此外，有研究报道，多柔比星能通过激活TGF-β信号通路，诱导三阴性乳腺癌细胞发生EMT[11]，这可能是多柔比星对三阴性乳腺癌治疗指数低和肿瘤耐药的重要分子基础。鉴于LSD1是三阴性乳腺癌细胞发生EMT的重要诱导因子，本实验将LSD1抑制剂Pargyline与多柔比星联合应用，分析优降宁与多柔比星对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化的影响；并进一步观察了Pargyline与多柔比星联合应用对4T-1细胞荷瘤小鼠生存期和肿瘤增殖的影响，以期为三阴性乳腺癌的临床治疗提供新的策略。
1 材料与方法 1.1 细胞株小鼠乳腺癌4T-1细胞购自中国典藏中心，由肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室传代并保存。
1.2 实验动物6周龄雌性BALB/c小鼠24只，体质量(18-22) g, 购自三峡大学医学部实验动物中心。在恒温(21-23) ℃、恒湿(45%-65%)、各12 h明暗周期的饲养室，每笼饲养4-6只小鼠，用全价颗粒饲料喂养，自由进食和饮水。许可证号：(SCXK(鄂)2017-0012)。
1.3 试剂Pargyline：购自美国MCE公司(批号：34106)；盐酸多柔比星：购自浙江海正药业股份有限公司；Transwell 24孔8 μm孔径小室：购自美国Costar公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒、乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒：购自上海碧云天生物技术有限公司；RIPA组织/细胞裂解液、30%制胶液、溴酚蓝：购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗人LSD1抗体、小鼠抗人E-cadherin抗体、兔抗人MMP-9抗体，兔抗人Vimentin抗体：购自美国Abcam公司；兔抗人β-actin抗体、HRP标记山羊抗小鼠二抗/山羊抗兔二抗：购自北京中杉金桥公司。
1.4 仪器Western blot电泳及电转膜系统，购自美国Bio-Rad公司；倒置显微镜、荧光倒置显微镜：购自日本尼康公司；全波长酶标仪：购自美国Thermo Fisher公司；化学发光成像显影仪：购自上海勤翔科学仪器有限公司。
1.5 CCK-8法检测肿瘤细胞增殖常规培养4T-1细胞，计数后调整细胞浓度，将5×103个细胞以100 μL/孔接种于96孔细胞培养板中，常规培养16 h后换用含终浓度为0、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10 mmol·L-1 Pargyline及含终浓度为0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5 mg·L-1 DOX的培养基继续培养24 h，每个药物浓度设置3个复孔。每孔按1 ∶10加入CCK-8溶液后于培养箱中孵育4 h；在450 nm波长处用酶标仪检测96孔培养板的吸光度值(A)，同时设置阴性对照与空白对照组。优降宁、多柔比星对4T-1细胞的生长抑制率按如下公式计算：生长抑制率/%=[(A实验组-A空白组)/(A阴性对照组-A空白组)]×100%。
1.6 CCK-8法检测优降宁与多柔比星联合应用对4T-1细胞增殖的影响按照上述方法操作，分别用含终浓度为0、0.25 mmol·L-1 Pargyline+0.05 mg·L-1 Dox、0.5 mmol·L-1 Pargyline+0.1 mg·L-1 Dox、1 mmol·L-1 Pargyline+0.25 mg·L-1 Dox、2.5 mmol·L-1 Pargyline+0.5 mg·L-1 Dox、5 mmol·L-1 Pargyline+1 mg·L-1 Dox、10 mmol·L-1 Pargyline+2.5 mg·L-1 Dox的培养基处理细胞24 h，在450 nm波长处检测吸光度值(A)。按照Chou-Talalay中位效应与联合指数模型[12]进行优降宁和多柔比星联合效应分析，实验数据以CompuSyn 2.0软件进行药物联合作用分析，两药物的联合指数(combination index，CI)＜1说明药物之间存在协同效应。
1.7 乳酸脱氢酶释放实验检测优降宁与多柔比星对4T-1细胞的毒性离心收集4T-1细胞，计数并调整细胞浓度为1×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，常规培养至至细胞密度为70%左右时，换用含终浓度为0、0.5、2.5、10 mmol·L-1 Pargyline与终浓度为0、0.05、0.1、0.5 mg·L-1 DOX的培养基继续培养24 h。每个药物浓度设3个复孔，同时设置无细胞组与阴性对照组。按照试剂盒操作说明书，加入LDH检测工作液60 μL后室温(25 ℃)避光孵育30 min，于490 nm处测定吸光度(A)。细胞毒性/%=(A药物处理组-A细胞对照组)/(A细胞最大酶活性组-A细胞对照组)×100。
1.8 划痕实验分析优降宁与多柔比星对4T-1细胞迁移能力的影响离心收集4T-1细胞，计数、调整细胞浓度后将5×104个细胞/孔接种于6孔细胞培养板中。常规培养至贴壁后，用200 μL枪头在培养板底部划“十”字形划痕并以PBS洗涤细胞2次后换用上述浓度药物处理24 h，同时设置阴性对照组。分别在药物处理后0 h、6 h、12 h时用倒置荧光显微镜观察取图；用ImageJ软件计算划痕面积(S)，分析药物对4T-1细胞迁移能力的影响。
1.9 Transwell实验分析优降宁与多柔比星对4T-1细胞迁移能力的影响按照上述细胞培养方法，以药物处理4T-1细胞24 h，并设置阴性对照组。收集上述细胞，用无血清培养基重悬洗涤2次。计数后，调整细胞密度为2.5×105个细胞/mL。向24孔细胞培养板中加入1 mL RPMI 1640培养基(10% FBS)，将Transwell小室置于培养孔中，向小室内垂直加入200 μL细胞悬液(5×104个细胞/小室)、于培养箱中继续培养8 h。取出Transwell小室，吸弃培养基，PBS润洗3次后，加入600 μL结晶紫-甲醇溶液染色15 min。PBS润洗3次后，用湿棉签拭去小室底部内侧面的细胞，然后置于载玻片上，使用倒置显微镜观察并取图。最后将小室置于避光处自然风干，以600 μL结晶紫溶剂(0.1 mol·L-1的枸橼酸钠50%乙醇溶液)溶解，使用酶标仪于540 nm波长检测OD值，由此对迁移细胞进行定量分析。
1.10 Transwell实验分析优降宁与多柔比星对4T-1细胞侵袭能力的影响取Transwell小室于24孔细胞培养板内，将Matrigel以1 ∶8比例用无血清培养基稀释后，按每小室50 μL加入并于37 ℃细胞培养箱中孵育过夜(约12 h)使其充分凝固。然后按前述方法加入Pargyline、Dox处理后的4T-1细胞，常规细胞培养24 h。最后，按前述方法以结晶紫染色、倒置荧光显微镜拍照取图；再加入结晶紫溶剂溶解后，用酶标仪于540 nm处检测其OD值，由此对侵袭细胞进行定量分析。
1.11 Western blot检测细胞EMT相关蛋白的表达水平RIPA裂解液提取各组药物处理24 h的4T-1细胞中的总蛋白并制备蛋白样后，以8% SDS-PAGE电泳，然后以电泳转移蛋白至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST洗膜后加入1% BSA稀释的一抗，4 ℃孵育过夜。然后以TBST洗膜，重复3次；再加入相应二抗于摇床上室温孵育1 h。TBST洗膜3次后加入ECL显影液，使用化学发光成像显影仪显影。最后用ImageJ分析目的蛋白条带的灰度值，目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/对应内参条带灰度值。
1.12 荷瘤小鼠模型验证优降宁与多柔比星对4T-1移植瘤的影响将4T-1细胞接种于24只5-6周龄雌性Balb/c小鼠腹部脂肪垫(5×105个/只)。4 d后观察成瘤，以随机分组法将小鼠分为4个组：Control组、Doxorubicin组、Pargyline组和Pargyline+Doxorubicin联合组，每组6只。肿瘤体积为10-20 mm3时腹腔给药：Pargyline 5 mg·kg-1[13]，Doxorubicin 0.5 mg·kg-1[14]；每连续给药3 d停药1 d，持续3周。每隔两天测量一次肿瘤长径a和短径b，并记录小鼠体重；最后根据公式V=ab2/2计算肿瘤体积。用药结束后，以CO2吸入法处死各组小鼠，取出肿瘤后称重、拍照，同时取小鼠心肝肾以4%多聚甲醛固定、70%乙醇处理并脱水后，石蜡包埋、切片进行H & E染色。
1.13 数据分析运用ImageJ、Graphpad Prism 8.0等软件进行灰度扫描、绘图及统计分析。
2 结果 2.1 优降宁与多柔比星明显抑制4T-1细胞增殖CCK-8法检测梯度浓度的优降宁、多柔比星处理后4T-1细胞的增殖水平，结果显示，优降宁与多柔比星均能有效抑制4T-1细胞的增殖，且抑制率均呈药物浓度依赖性增高(Fig 1A)。乳酸脱氢酶释放实验检测结果表明，当优降宁与多柔比星的浓度分别等于或低于2.5 mmol·L-1和0.1 mg·L-1时，对4T-1细胞无明显细胞毒性(P < 0.05)(Fig 1B)。由于此浓度优降宁与多柔比星均可有效抑制4T-1细胞增殖，故使用2.5 mmol·L-1 Pargyline和0.1 mg·L-1 Doxorubicin用于后续实验。
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| Fig 1 Effects of pargyline and doxorubicin on proliferation and cytotoxicity of 4T-1 cells(100×) 4T-1 cells were respectively treated with different concentrations of pargyline (0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0 mmol·L-1) and doxorubicin (0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 mg·L-1) for 24 h. The inhibitory rate (A) and cytotoxicity (B) were respectively detected by CCK-8 method and LDH assay.x±s, n=3, t-test, **P < 0.01 vs control. |
为分析优降宁与多柔比星联合使用对4T-1细胞增殖的影响，本研究中我们使用Chou-Talalay方法计算联合指数(combination index，CI)值来评估两药之间的药物协同作用。实验数据分析表明，两种药物联合应用能有效地抑制4T-1细胞生长，二者之间的联合指数(CI)＜1，显示出药物协同抑制效应(Fig 2)。
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| Fig 2 Analysis of combined use of pargyline and doxorubicin A: The CI values of pargyline and doxorubicin at ED50, ED75, ED90; B: Distribution of CI values of pargyline combined with doxorubicin; C. Analysis of the synergistic effect of pargyline and doxorubicin in inhibiting the proliferation of 4T-1 cells. |
细胞划痕实验结果显示，优降宁能有效抑制4T-1细胞的迁移，但0.1 mg·L-1多柔比星无此影响，而两药联用对4T-1细胞迁移的抑制作用比单用优降宁更为明显(Fig 3)；类似地，Transwell迁移实验结果也证实，单独使用2.5 mmol·L-1 Pargyline处理4T-1细胞可抑制其迁移能力，而0.1 mg·L-1 Doxorubicin则对4T-1细胞的迁移能力具有促进作用。与单用优降宁相比，两药联用能更有效地抑制4T-1细胞迁移(Fig 4)。
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| Fig 3 Effects of pargyline and doxorubicin on migration ability of 4T-1 cells analyzed by scratch test(100×) 4T-1 cells were treated with pargyline 2.5 mmol·L-1, doxrubicin 0.1 mg·L-1, doxrubicin 0.1 mg·L-1+pargyline 2.5 mmol·L-1 for 0, 6, and 12 h, respectively. Scratch experiment was performed to analyze the effect on migration ability of 4T-1 cells. |
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| Fig 4 Effects of pargyline and doxorubicin on migration ability of 4T-1 cells with Transwell experiment(x±s, n=3) Transwell assay (A) was carried out to investigate the migration ability of 4T-1 cells, treated respectively with pargyline 2.5 mmol·L-1, doxrubicin 0.1 mg·L-1, doxrubicin 0.1 mg·L-1+pargyline 2.5 mmol·L-1 for 7 h(×100). The number of migrated cells were shown in quantized graph (B). 1:Control; 2:Dox 0.1 mg·L-1; 3:Pargyline 2.5 mmol·L-1; 4:Dox 0.1 mg·L-1+Pargyline 2.5 mmol·L-1. t-test, **P < 0.01 vs control. |
在前述迁移实验的基础上，进一步使用Transwell侵袭实验分析了优降宁与多柔比星单独或联合应用对4T-1细胞的侵袭能力的影响。实验结果显示，0.1 mg·L-1 Doxorubicin能明显促进4T-1细胞的侵袭，2.5 mmol·L-1优降宁单独或与0.1 mg·L-1 Doxorubicin联合应用均可明显抑制4T-1细胞的侵袭(Fig 5)。
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| Fig 5 Effects of pargyline and doxorubicin on invasion ability of 4T-1 cells with Transwell experiment(x±s, n=3, 100×) Transwell assay (A) was implemented to resolve the invasion ability of 4T-1 cells, treated respectively with pargyline 2.5 mmol·L-1, doxrubicin 0.1 mg·L-1, doxrubicin 0.1 mg·L-1+pargyline 2.5 mmol·L-1 for 7 h(×100). The number of invaded cells was shown in quantized graph (B).1:Control; 2:Dox 0.1 mg·L-1; 3:Pargyline 2.5 mmol·L-1; 4:Dox 0.1 mg·L-1+Pargyline 2.5 mmol·L-1.**P < 0.01 vs control. |
利用Western blot方法检测了优降宁与多柔比星对4T-1细胞中EMT相关标志分子表达水平的影响。结果显示，与对照组相比，多柔比星对上皮细胞标志分子E-cadherin和间质细胞标志分子MMP-9和Vimentin的表达水平无明显影响，而单用优降宁可明显上调E-cadherin表达并下调MMP-9和Vimentin的表达水平，二者联合应用时，趋势更为明显(Fig 6)。
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| Fig 6 Effects of pargyline and doxorubicin on expression of EMT-related proteins in 4T-1 cells(x±s, n=3) 1:Control; 2:Dox 0.1 mg·L-1; 3:Pargyline 2.5 mmol·L-1; 4:Dox 0.1 mg·L-1+Pargyline 2.5 mmol·L-1. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control. |
荷瘤小鼠模型验证优降宁与多柔比星联合应用对4T-1移植瘤的影响。结果显示，优降宁对4T-1移植瘤的生长无明显影响，多柔比星虽有抑制瘤体生长的趋势，但未达明显性水平，而上述两药联合应用则能有效抑制4T-1移植瘤的生长(Fig 7A-C)，与对照组相比，差异有显著性(P < 0.05)。与此类似，仅两药联合应用能明显延长荷瘤小鼠的生存期(Fig 7D)。此外，二种药物单用或联用对小鼠的体重均无明显影响(Fig 7E)；也未对荷瘤小鼠心、肝、肾产生明显的药物毒性(Fig 7F)。
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| Fig 7 The inhibitory effect of pargyline and doxorubicin on growth of 4T-1 cell-bearing mice(x±s, n=6, 100×) Tumor volume (A), entity view of tumor (B), tumor weight (C) (t-test) and survival rate (D) (Fisher's exact probability method) were recorded to analyze the inhibitory effect on the proliferation of 4T-1 cells in vivo. Body weight (E), and H & E staining (F) of heart, liver and kidney of mice were employed to evaluate the toxity of drugs. 1:Control; 2:Dox 0.5 mg·kg-1; 3:Pargyline 5 mg·kg-1; 4:Dox 0.5 mg·kg-1/Pargyline 5 mg·kg-1. *P < 0.05 vs control. |
EMT是被定义为丢失上皮特性的一种细胞重编程过程，包括细胞间粘附和上皮细胞标志物的表达，以及更具迁移性的间充质表型的获得[15]。研究表明，EMT有促进肿瘤细胞转移和侵袭的作用[16]。Snail通过募集LSD1并结合相关上皮粘附分子的基因启动子区，由LSD1催化其组蛋白H3K4me1/2去甲基化，可抑制相关基因表达[17]。这一机制在乳腺癌细胞发生上皮细胞间充质转化的过程中也发挥重要作用，导致乳腺癌细胞迁移和转移增加[5-6]。同时，有研究表明，作为治疗乳腺癌的一线化疗药物多柔比星(Doxorubicin)，可通过促进癌细胞发生EMT，而促进包括乳腺癌在内的多种癌症的侵袭转移[18-19]，这可能是多柔比星对三阴性乳腺癌治疗指数低和肿瘤耐药的重要分子基础。基于上述背景，本实验将LSD1抑制剂优降宁与多柔比星联合应用，在细胞和实验动物的水平上，分析了优降宁和多柔比星联合应用对三阴性乳腺癌细胞增殖，侵袭和迁移的影响。结果显示，优降宁与多柔比星联合应用能够产生药物协同作用抑制4T-1细胞增殖。重要的是，低浓度多柔比星能够促进4T-1细胞的迁移和侵袭，而优降宁与多柔比星联合应用可明显抑制4T-1细胞的迁移和侵袭。其中优降宁处理导致上皮细胞标志分子E-cadherin表达上调、EMT相关蛋白MMP-9和Vimentin表达下调，这可能是其抑制4T-1细胞迁移侵袭能力的分子基础。在荷瘤小鼠模型中，单独使用优降宁或低剂量多柔比星不能明显抑制4T-1移植瘤的生长和影响小鼠生存期。但优降宁与低剂量多柔比星联合应用能够明显抑制4T-1移植瘤的生长和延长小鼠生存期，这一结果提示优降宁与多柔比星联合应用产生的药物协同作用和对LSD1活性的抑制作用具有重要的意义，即：一方面降低多柔比星有效剂量可使其药物毒副作用减小，另一方面有效地抑制多柔比星的促EMT作用，由此抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。此外，Pargyline(优降宁)作为临床已经应用的药物，有利于快速推进以LSD1为靶点的抗肿瘤治疗研究及其应用。
综上所述，本实验研究结果为三阴性乳腺癌的临床治疗提供了新思路，提示优降宁与多柔比星联合用药在乳腺癌临床治疗中具有潜在应用价值。
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