2. 广东省人民医院(广东省医学科学院) 医学研究部临床药理重点实验室，广东 广州 510080;
3. 华南理工大学医学院，广东 广州 510006;
4. 广东省心血管病研究所心血管内科，广东 广州 510080
2. Guangdong Provincial Key Lab of Clinical Pharmacology, Medical Research Center of Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China;
3. School of Medicine, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China;
4. Cardiovascular Internal Medicine of Guangdong Cardiovascular Institute, Guangzhou 510080, China
血管平滑肌收缩和舒张功能异常是多种心血管疾病的重要病理变化，如：高血压、糖尿病以及动脉粥样硬化等。Ca2+是平滑肌细胞内的重要的第二信使，在平滑肌收缩和舒张中扮演着重要角色，其发生调节紊乱可导致平滑肌舒缩功能异常[1]。正常血管平滑肌细胞内Ca2+浓度的调节依赖两种方式：① 细胞内外Ca2+的交换；② 细胞内钙库的调节。通常，在细胞膜控制细胞内外Ca2+交换主要有3种通道：① 电压操纵性钙通道，如：L-型钙通道；② 钙库操纵性钙通道(Store-operated calcium channels，SOCC)；③ 受体操纵的钙通道。其中，近年确定了SOCC分子基础为: STIM1(stromal interacting molecules)和Orai1蛋白。STIM1是内质网钙库耗竭诱导外钙内流的感受器，能够感受内质网内Ca2+浓度变化；Orai1是形成SOCC通道孔的跨膜蛋白。其激活机制为：当内质网钙库耗竭后，STIM1感受信号，在内质网上进行重新分配，聚集并迁移到内质网膜和细胞膜结合点上，募集细胞膜上的Orai1，将信号传递给Orai1，Orai1发生构象变化，形成功能性钙库排空激活的钙通道，介导细胞外钙内流[2]。随后在两个不同的实验室同时研究发现，STIM1还同时直接抑制L-型钙通道电流[3-4]。
SOCC最早是在不可兴奋性细胞上，如：免疫细胞、内皮细胞、血小板等[5-6]，主要参与“兴奋-转录偶联”过程，激活多种转录因子，包括：血清反应因子、活化T细胞核因子和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白。近年越来越多的研究表明，在兴奋性细胞上如：神经细胞、心肌细胞、平滑肌细胞等，也存在SOCC[7-8]。然而，在血管平滑肌上，SOCC的器官分布和功能表达等，是否参与平滑肌细胞收缩过程，即“兴奋-收缩偶联”，都有待进一步阐明。因此，本研究借助平滑肌特异性STIM1敲除小鼠，探索STIM1介导的SOC在主动脉平滑肌收缩功能调控中的作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物C57BL/6(sm-STIM1-WT)和平滑肌STIM1敲除(sm-STIM1-KO)8周龄雄性小鼠，SPF级，各20只，购于江苏集萃药康生物科技有限公司，许可证号：SCXK(苏)2018-0008，在华南理工大学实验动物中心喂养至20周备用。本研究所有动物实验已通过广东省人民医院(广东省医学科学院)的动物实验伦理审查(No.GDRE201208a)。
1.2 试剂与仪器苯肾上腺素(phenylephrine，Phe，039K1453)、5-羟色胺(serotonin，5-HT，091M5163V)、U46619(血栓素TXA2类似物)、二甲基亚砜(DMSO，015K0151)、硝苯地平(57H1139)、乙酰胆碱(Ach，115K0706)、毒胡萝卜素(thapsigargin，TG，049M4032V)、咖啡因(caffeine，71K1877)、EGTA(111K5411)均购于Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。610M型多通道血管张力测定仪(DMT公司，丹麦)；Power Lab 8/30生物信号采集处理系统(AD公司，澳大利亚)；XTL250型体式显微镜；DK-8D型电热恒温水槽(上海医用恒温设备厂)；蛋白电泳仪、转膜仪(北京市六一仪器厂)；抗GAPDH鼠多克隆抗体(Proteintech公司)；抗STIM1兔多克隆抗体(Proteintech公司)。
1.3 实验溶液Krebs Henseleit(K-H)溶液(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO3 25、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO4 1.2、CaCl2 2.5、D-glucose 11.1；高钾K-H溶液(mmol·L-1)：KCl 60、NaCl 63.7、NaHCO3 25、MgCl2·6H2O 1、KH2PO4 1.2、CaCl2 2.5、D-glucose 11.1。无钙K-H溶液(mmol·L-1)：NaCl 119、NaHCO3 25、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO4 1.2、D-glucose 11.1、EGTA 0.05。实验所用溶液配好后均通混合气(95% O2+5% CO2)充分饱和。
1.4 平滑肌STIM1敲除鼠的制备采用Cre-lox重组技术制备平滑肌特异性STIM1敲除小鼠，利用平滑肌特异性SM22α-CreKI+小鼠与STIMfl/fl小鼠杂交，导致平滑肌细胞中的STIM1的外显子2特异性完全缺失，构建sm-STIM1-KO小鼠。SM-22α-CreKI+/-/STIMWT (sm-STIM-WT) 作为对照组。观察sm-STIM1-WT和sm-STIM1-KO小鼠外观形态变化。提取小鼠主动脉组织蛋白，Western blot技术检测STIM1表达变化，验证STIM1敲除鼠制备成功。
1.5 小鼠离体主动脉环制备血管环制备方法同以前发表文献处理[9-10]。采用颈椎脱臼方法处死小鼠，迅速取出主动脉，并置于4 ℃ K-H溶液中。在体式显微镜下去除多余的脂肪和结缔组织，并剪成2.0 mm的血管环，机械法去除内皮。显微镜下将血管环直接固定于血管张力测定仪浴槽内的两个钳夹上，平衡30 min，调节基础张力至3 mN，每隔15 min换液1次，并使张力维持在3 mN，平衡60 min后开始加入药物进行实验，计算机程序控制下完成记录。浴槽内的溶液在实验过程中温度一直保持稳定在(37±0.5)℃，且持续通入95% O2和5% CO2混合气体。
1.6 实验药物对离体小鼠主动脉血管环张力变化的影响血管功能性及内皮完整性检测同以前发表文献处理[9-10]。对于血管功能性检测合格且去内皮完全的血管，平衡完成后，用1 μmol·L-1 Phe诱导血管收缩，达到收缩平衡后，用无钙K-H溶液洗脱4次，随后用2 μmol·L-1毒胡萝卜素(TG，肌浆网钙泵抑制剂)和1 μmol·L-1硝苯地平(Nifedipine, L-型钙通道阻断剂)孵育30 min，加入2.5 mmol·L-1 CaCl2，观察sm-STIM1-WT和sm-STIM1-KO小鼠主动脉血管收缩反应性差异。
采用累积浓度给药方法，观察Phe(0.001-10 μmol·L-1)、5-HT(0.001-10 μmol·L-1)和U46619 (0.000 1-1 μmol·L-1)诱导的两组小鼠主动脉环收缩反应差别。当收缩反应达到最大值，用K-H液洗脱4次，并给予1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min，重复以上Phe和5-HT累积浓度给药，观察硝苯地平对两组血管收缩的影响；随后用无钙K-H液洗脱4次，给予1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min，重复Phe和5-HT累积浓度给药，进一步观察在硝苯地平孵育下，无钙K-H液中两组血管收缩的变化。
用高钾溶液刺激血管，待达到最大收缩反应不再变化后，加入1 μmol·L-1硝苯地平孵育30 min。加入1 μmol·L-1 Phe，收缩稳定后用高钾洗脱4次，再加入30 μmol·L-1 SKF96365孵育30 min，再次加入1 μmol·L-1 Phe刺激血管，比较Phe诱导sm-STIM1-WT和sm-STIM1-KO小鼠主动脉血管环收缩差异。血管平衡完成后，直接向浴槽中依次加入5 mmol·L-1、10 mmol·L-1和20 mmol·L-1无钙K-H溶液配制的咖啡因，统计咖啡因诱导的血管收缩峰值、达峰时间和下降的时间常数(τ)。
1.7 实验数据分析和统计学处理数据分析参考以前发表文献[11]。以连续两次高钾刺激血管收缩张力的均值作为标准值(100%)，各浓度药物引起血管收缩的大小以占标准值的百分比来表示。半数有效量(EC50)是指产生最大效应Emax的50%时所需激动剂摩尔浓度，pD2=-lg(EC50)。pD2和Emax由GraphPad Prism(San Diego，CA)软件计算出。数据的表示方式为x±s，采用Sigma Plot 10.0(Systat，US)作图软件绘制收缩曲线。数据均使用SPSS 25.0(IBM，Armonk，NY，USA)软件进行统计分析，两组数据比较采用t检验，血管收缩量效曲线的整体水平比较采用一般线性模型下的单变量分析。文中n代表主动脉血管环例数。
2 结果 2.1 平滑肌STIM1敲除鼠制备成功sm-STIM1-KO和sm-STIM1-WT小鼠，以及C57BL/6小鼠之间的外观形态无明显差异。Western blot结果显示，sm-STIM1-KO小鼠主动脉STIM1蛋白的表达水平基本消失，提示平滑肌STIM1敲除鼠制备成功，见Fig 1。
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| Fig 1 Generation of smooth muscle-targeted STIM1-KO mice A: Scheme of cre-lox technology of smooth muscle-targeted STIM1-knockout. B: Appearance of sm-STIM1-WT mice, sm-STIM1-KO mice, and C57/B6 at 20 weeks of age. C: The protein expression levels of STIM1 in aorta tissues from SM-STIM1-WT and SM-STIM1-KO mice. |
Phe引起sm-STIM1-KO和sm-STIM1-WT小鼠血管收缩，用无钙K-H洗脱，硝苯地平和TG孵育30 min后，在sm-STIM1-KO小鼠中发现CaCl2引起的血管收缩消失。提示STIM1参与小鼠主动脉SOCC介导的血管收缩，见Fig 2。
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| Fig 2 Alteration in vasoconstriction of sm-STIM1-KO mouse aortic rings mediated by SOCC A: Representative traces showing vasoconstriction of mouse aortic rings mediated by SOCC. B: A summary graph of Ca2+-induced contraction mediated by SOCC. Results are expressed as x±s, sm-STIM1-WT: n=8; sm-STIM1-KO: n=4; **P < 0.01 vs sm-STIM1-KO group. |
Phe诱导小鼠主动脉呈浓度依赖性收缩；和野生型小鼠相比，sm-STIM1-KO小鼠对Phe的收缩反应没有变化，收缩量效曲线pD2和Emax均没有明显差异。经L-型钙通道阻滞剂硝苯地平孵育后，两组小鼠血管收缩均被抑制，且sm-STIM1-KO小鼠血管收缩显著低于野生型小鼠(Emax：32.23±3.69 vs 3.38±2.48；pD2：6.95±0.16 vs 7.05±0.40，n=4-11；P < 0.01)。在硝苯地平孵育的无钙K-H溶液中，sm-STIM1-KO小鼠几乎未引起血管收缩(Emax：19.90±5.64 vs 1.34±0.37；pD2：7.04±0.49 vs 6.12±0.42，n=6-11；P < 0.01)，提示肌浆网钙释放介导的血管收缩受损，见Fig 3。
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| Fig 3 Response of aorta to Phe in sm-STIM1-KO mice A, C: Representative traces of Phe-induced concentration-dependent contraction in aortic rings in the presence or absence of nifedipine (1 μmol·L-1). B, D: Concentration-response curves were constructed. Results are expressed as x±s, sm-STIM1-WT: n=11-14; sm-STIM1-KO: n=4-14; **P < 0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine group, ##P < 0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine+Ca2+-free K-H group. |
5-HT引起小鼠主动脉呈浓度依赖性收缩；sm-STIM1-KO小鼠对5-HT的反应较野生型小鼠没有显著性变化；硝苯地平孵育后，血管收缩明显降低，且sm-STIM1-KO小鼠血管收缩低于野生型小鼠(Emax：63.95±13.05 vs 13.75±9.16；pD2：6.59±0.08 vs 6.76±0.75，n=4-8；P < 0.01)；在硝苯地平孵育的无钙K-H溶液中，sm-STIM1-KO小鼠血管收缩低于野生型小鼠(Emax：29.31± 7.96 vs 6.00±3.49；pD2：6.64±0.15 vs 6.56±0.27，n=6-11；P < 0.01)，见Fig 4。
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| Fig 4 Response of aorta to 5-HT in sm-STIM1-KO mice A, C: Representative traces of 5-HT-induced concentration-dependent contraction in aortic rings in the presence or absence of nifedipine (1 μmol·L-1). B, D: Concentration-response curves were constructed. Results are expressed as x±s, sm-STIM1-WT: n=8-14; sm-STIM1-KO: n=4-12; **P < 0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine group, ##P < 0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine+Ca2+-free K-H group. |
U46619引起小鼠主动脉呈浓度依赖性收缩；sm-STIM1-KO小鼠和野生型小鼠对U46619的反应差异无统计学意义；在有钙和无钙的K-H溶液中，经硝苯地平孵育后，两组血管收缩均被抑制，sm-STIM1-KO小鼠血管收缩低于野生型小鼠(在有钙的K-H溶液中，Emax：149.60±13.31 vs 54.02±4.97；pD2：7.95±0.07 vs 7.36±0.27，n=10-12；P < 0.01。在无钙K-H溶液中，Emax：84.18±21.39 vs 38.63±14.05；pD2：7.49±0.15 vs 7.18±0.50，n=10-12；P < 0.01)，见Fig 5。
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| Fig 5 Response of aorta to U46619 in sm-STIM1-KO mice A, C: Representative traces of U46619-induced concentration-dependent contraction in aortic rings in the presence or absence of nifedipine (1 μmol·L-1). B, D: Concentration-response curves were constructed. Results are expressed as x±s, sm-STIM1-WT: n=9-12; sm-STIM1-KO: n=10-14; **P < 0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine group, ##P < 0.01 vs sm-STIM1-WT+nifedipine+Ca2+-free K-H group. |
高钾溶液引起小鼠主动脉持续收缩；硝苯地平完全阻断了高钾溶液引起的血管收缩，加入血管收缩剂Phe，sm-STIM1-WT小鼠主动脉持续收缩，而sm-STIM1-KO小鼠迅速收缩(快相)随后下降至平稳收缩(慢相)。统计两相血管收缩值发现，sm-STIM1-KO快相收缩峰值降低但差异无有统计学意义，慢相收缩低于sm-STIM1-WT小鼠(31.60±3.42 vs 3.38±1.86，n=5-8；P < 0.01)。两组血管收缩均被SOCC非特异性抑制剂SKF96365抑制，见Fig 6。
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| Fig 6 STIM1 involved in non-L-type calcium channel-mediated vasoconstriction A: Representative trace of vasoconstriction in mouse aorta with different Ca2+ channel blockers treatment. B: A summary graph of the maximal response to Phe (fast phase) in a 60 mmol·L-1 KCl, nifedipine (1 μmol·L-1) solution. C: A summary graph of slow phase of constant vasoconstriction in a 60 mmol·L-1 KCl, nifedipine (1 μmol·L-1) solution. Results are expressed as x±s, sm-STIM1-WT: n=5; sm-STIM1-KO: n=8; **P < 0.01 vs sm-STIM1-WT. |
咖啡因引起血管迅速收缩，随着咖啡因浓度增加，其诱导的收缩增加，最大收缩值统计结果显示，各浓度咖啡因诱导的最大收缩值在sm-STIM1-WT和sm-STIM1-KO小鼠主动脉反应中没有差异；但两组达峰时间结果显示，10 mmol·L-1和20 mmol·L-1咖啡因诱导的血管收缩达峰时间在sm-STIM1-KO小鼠主动脉中均快于sm-STIM1-WT小鼠。同时，sm-STIM1-KO小鼠主动脉收缩下降速度也明显快于sm-STIM1-WT小鼠，见Fig 7。
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| Fig 7 Response of aorta to caffeine in sm-STIM1-KO mice A: Representative trace of vasoconstriction induced by caffeine of different concentrations in mouse aorta. B: A summary graph of caffeine-evoked contraction. C: A summary graph of time reaching Emax of vasoconstriction. D: τ of vasoconstriction in sm-STIM1-WT and sm-STIM1-KO mice. Results are expressed as x±s, sm-STIM1-WT: n=6-10; sm-STIM1-KO: n=9; *P < 0.05 vs sm-STIM1-WT. |
本研究我们成功地建立平滑肌特异性STIM1敲除小鼠模型，结果发现STIM1敲除小鼠钙库操纵性钙通道介导的收缩完全消失，但是，不同收缩剂(Phe、5-HT和U46619)诱导STIM1敲除小鼠主动脉平滑肌总的收缩无明显变化，进一步研究，发现STIM1敲除对非电压依赖性钙通道和肌浆网钙释放诱导的收缩有明显抑制作用。
Ca2+是平滑肌细胞内的重要的第二信使，在平滑肌收缩中扮演着重要角色。血管收缩主要受细胞内Ca2+浓度变化影响，细胞内Ca2+浓度增加时，Ca2+与钙调蛋白结合，激活肌球蛋白轻链激酶，使肌球蛋白轻链磷酸化引起平滑肌收缩。Phe、5-HT和U46619通过分别结合平滑肌细胞膜上的α1受体、5-HT2A受体和TXA2受体，偶联G蛋白信号通路引起血管收缩。一方面直接激活L-型钙通道开放，引起细胞外钙离子内流；另一方面激活磷脂C (PLC)，使磷脂酰肌醇二膦酸(PIP2)水解为三磷酸肌醇(IP3) 和二脂酰甘油(DAG)。DAG可激活蛋白激酶C(PKC)，增加血管平滑肌对钙离子敏感性；IP3则与肌浆网膜上IP3受体结合，诱导肌浆网内Ca2+释放，引起血管收缩，当肌浆网内钙库耗竭，SOCC通道打开，细胞外Ca2+流入[12]。目前研究证据表明，在血管平滑肌细胞中存在SOCC，也已确定Orai1和STIM1是其两个关键的组成成分。较多的证据表明[13-14]，在高血压和血管损伤再狭窄中发现STIM1和Orai1表达明显上调，SOCC钙信号增强，Calcineurin(CaN)/ NFAT通路活化，在参与平滑肌细胞增殖和迁移等功能中发挥着重要作用。但是，SOCC在平滑肌细胞是否参与收缩功能，在不同的器官和疾病模型上仍存在争议。
Yang等[15]研究发现，老年大鼠肠系膜小动脉SOCC介导的收缩增强，SOCC相关蛋白表达增加，其介导的血管平滑肌细胞钙内流明显增强，主动脉上SOCC的表达变化则相反。Giachini等[13]研究发现，在自发性高血压大鼠主动脉血管平滑肌上STIM1蛋白表达明显增加，TG诱导的SOCC介导的收缩反应也明显增加；当用STIM1蛋白抗体阻断后，其收缩反应恢复正常，提示SOCC介导的钙内流增加，参与诱发高血压血管收缩高反应。另外研究显示，在冠状动脉SOCC介导的血管收缩并不明显[16]。本研究我们建立平滑肌特异性敲除STIM1小鼠模型，通过蛋白检测，证明平滑肌特异性STIM1敲除成功，同时也提示，STIM1介导SOCC参与主动脉收缩反应，与之前的研究一致。同时，在平滑肌特异性敲除STIM1小鼠主动脉上，发现Phe、5-HT和U46619诱导的收缩量效曲线pEC50和Emax均没有明显变化；但是在L-型钙通道阻断剂Nifedipine存在情况下，非电压依赖性钙通道介导的收缩明显减少；其次，在无钙条件下，激动剂诱导的收缩也是明显降低的。
为进一步探究钙调控在平滑肌特异性STIM1敲除主动脉血管收缩变化中的机制，用高钾溶液(60 mmol·L-1 KCl)刺激血管，引起血管收缩，提示L-型钙通道参与血管收缩。高钾溶液使细胞膜去极化，进而激活与膜电位有关的L-型钙通道，引起细胞内Ca2+浓度增加；我们进一步探讨了平滑肌特异性STIM1敲除对非L-型钙通道介导的主动脉收缩的变化。在高钾溶液引起血管最大收缩后，加入硝苯地平完全阻断了高钾溶液引起的血管收缩，随后加入Phe仍可引起血管收缩，此时血管收缩主要由非L-型钙通道介导，Phe引起的血管收缩明显降低，对快相的收缩没有明显影响，但是，对持续相有明显的抑制作用，进一步提示SOCC参与血管收缩。
最后，探讨了平滑肌特异性STIM1敲除对小鼠主动脉肌浆网钙释放的影响。咖啡因诱导平滑肌收缩主要由细胞肌浆网内释放的Ca2+介导，结果表明其收缩幅度变化不明显，但上升速度和下降的速度均加快，提示，STIM1敲除后平滑肌细胞肌浆网钙释放和回收功能均受到影响，导致钙调控异常。
综上所述，本实验通过对离体平滑肌特异性STIM1敲除小鼠主动脉张力的测定，发现L-型钙通道、肌浆网钙释放和SOCC均参与小鼠主动脉平滑肌收缩，STIM1参与SOCC和肌浆网钙释放介导的血管收缩，这一发现为血管病变的治疗提供新的靶点。另外，可能主动脉存在代偿机制，当STIM1介导的SOCC依赖性收缩较少时，L-型钙通道依赖的收缩信号通路进行代偿，维持血管稳态和功能。但本实验仅对离体小鼠主动脉血管收缩张力进行了分析，下一步将在细胞和分子水平上，以及其它器官血管和疾病模型上，进一步探讨STIM1参与平滑肌细胞钙调控的病理生理机制。
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