2. 西北民族大学附属医院检验科，甘肃 兰州 730030;
3. 兰州大学第一附属医院肿瘤外科，甘肃 兰州 730000
2. Affiliated Hospital of Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China;
3. Dept of Surgical Oncology, the First Affiliated Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
白血病是造血系统的恶性肿瘤，主要临床表现为出血、感染、贫血和多器官浸润等，病情进展迅速，病死率高。其发病原因和发病机制目前尚不完全清楚[1]。白血病的治疗方针是通过合理的综合性治疗，使白血病患者的预后得到极大改善，获得治愈或长期稳定生存[2]。化疗依然是治疗白血病的主要方法，但化疗过程中药物诱导产生的耐药现象是临床化疗失败的主要原因之一。白血病耐药发生率约占白血病治疗人数的33%[3]，根据其发生原因不同分为两类：一类是细胞天然对某种化疗药物产生耐受，称为原发性耐药(primary drug resistance); 另一类是化疗药物长期作用后细胞对该种药物产生抵抗或耐受现象，称为继发性耐药(secondary resistance), 有些白血病细胞甚至会产生继发性多药耐药现象(multidrug resistance，MDR)[4]。MDR的发生机制非常复杂，近年来研究发现，铂类药物和烷化剂等耐药与细胞自噬水平有关[5]。本研究以慢性髓系白血病K562细胞为研究对象，用蒽环类化疗药物阿霉素(adriamycin，ADM)体外“逐步提高药物浓度+间歇性刺激”的方式逐步诱导建立对ADM有稳定耐药性的K562/ADM细胞，一方面观察K562/ADM细胞对吡柔比星、柔红霉素等其它化疗药物是否有交叉耐药现象，从而筛选出与常规化疗药物不存在交叉耐药的新型药物，为临床攻克白血病MDR提供研究基础。另一方面我们通过观察耐药前后细胞自噬水平的变化，并用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)抑制细胞自噬，观察自噬水平对K562/ADM细胞化疗敏感性及耐药相关蛋白表达的影响，旨在研究K562/ADM细胞产生耐药的机制。
1 材料与方法 1.1 细胞、试剂与仪器 1.1.1 细胞株人类白血病K562细胞购自American Type Culture Collection (ATCC，Manassas，USA)。
1.1.2 K562/ADM细胞的诱导与建立以K562细胞为靶细胞，从ADM浓度0.02 μmol·L-1开始，采用“逐步提高药物浓度+间歇性刺激”的方式逐步诱导其对ADM产生耐药，最终诱导产生能够稳定耐受15 μmol·L-1 ADM的耐药细胞，称之为K562/ADM细胞，该细胞在液氮中冻存3个月以上复苏后其耐药性依然维持稳定。
1.1.3 试剂MTT(M2003)，三氧化二砷(arsenictrioxide，As2O3)购自美国Sigma公司，As2O3用0.1 mol·L-1 NaOH溶解后，用PBS配制成10 mmol·L-1的贮存液; ADM(国药准字：H44024359)购自深圳万乐药业有限公司; 柔红霉素(国药准字：H20058349)、吡柔比星(国药准字：H20045982)购自浙江海正药业有限公司; 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)(国药准字：H31020593)购自上海旭东海普药业有限公司; 长春新碱(国药准字：H20064346)购自广东岭南制药有限公司; 单丹黄酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)(货号：30432)购自美国Sigma公司; 蛋白提取及定量试剂盒(索莱宝公司); 兔源LC3-Ⅰ/Ⅱ(货号：#4108)、Beclin-1(货号：#3495)、p62(货号：#5114)、P-gp(货号：#13978)、MRP1(货号：#72202)、BCRP(货号：#4477)一抗和鼠源β-actin一抗(货号：#3700)均购自美国CST公司; IRDye800DX标记的羊抗鼠(C80816-10)和IRDye700DX标记的羊抗兔(C81106-06)红外荧光抗体均购自LI-COR公司。
1.1.4 仪器CO2细胞培养箱(日本三洋公司); 红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR公司); 酶联免疫检测仪(美国Bio-Tek公司); 透射电镜(日本电子公司); 转印电泳仪(北京六一仪器厂); 荧光显微镜(日本OLYMPUS公司); 流式细胞仪(美国BECKMAN COULTER)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养与处理K562细胞及K562/ADM细胞以5×104个·L-1接种到含10%胎牛血清及2 mmol·L-1谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中，置于5% CO2、37 ℃及饱和湿度培养箱中进行常规培养。
1.2.2 MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性将处于对数生长期的K562细胞和K562/ADM细胞分别按5×107·L-1接种96孔板，按照一定梯度分别加入不同浓度的阿霉素、柔和霉素、As2O3、吡柔比星、5-FU、长春新碱等，5 % CO2、37 ℃培养箱中分别培养24、48和72 h, 于培养终止前4 h每孔加入MTT(5 g·L-1)10 μL，继续培养4 h，每孔加入10%SDS后放培养箱过夜，用酶联免疫检测仪570 nm波长检测吸光值(A值)，依据细胞生长抑制率公式计算药物对细胞的增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50)，每个浓度设4个复孔。抑制率计算公式为：细胞生长抑制率/%＝(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。
1.2.3 透射电镜观察细胞的自噬形态学改变收集细胞，PBS洗涤，3%戊二醛固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，切片，枸橼酸铅及醋酸铀双重染色，透射电镜观察细胞的超微结构。
1.2.4 MDC染色荧光显微镜观察细胞自噬水平在培养的K562细胞和K562/ADM细胞中分别加入酸性囊泡染液MDC使其终浓度为0.05 mmol·L-1，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗涤，调整细胞浓度并滴片，用荧光显微镜观察细胞自噬变化。
1.2.5 Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率离心收集细胞，PBS洗涤，结合缓冲液重悬细胞，加入Annexin-V和PI染液，避光孵育，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。
1.2.6 Western blot法检测自噬及耐药相关蛋白的表达收集各组细胞，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸5 min后上样，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转法转膜、5%脱脂奶粉+PBST封闭，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后按1 ∶ 10 000比例加入IRDye700DX和IRDye800CW二抗室温孵育2 h，TBST洗涤，用Odyssey红外荧光扫描仪扫描并分析。
1.2.7 统计学分析实验数据采用SPSS 17.0软件进行分析处理，组间比较采用t检验。
2 结果 2.1 ADM对K562细胞及K562/ADM细胞的增殖抑制作用不同浓度ADM对亲本K562细胞和K562/ADM细胞的增殖抑制程度存在明显差异(Fig 1A)。ADM对K562细胞24 h、48 h和72 h的IC50分别为5.53、3.87和0.74 μmol·L-1; 而ADM对K562/ADM细胞24 h、48 h和72 h的IC50分别为134.4、79.7和53.8μmol·L-1(Fig 1B)，3个时间段的药物抗性系数均大于20。
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| Fig 1 The inhibitory effect of ADM on K562 and K562/ADM cells (x±s, n=4) A: Different inhibitory effect of ADM on K562 cells and K562/ADM cells for 48 h. B: IC50 of different time, *P < 0.05, **P < 0.01 vs K562 cells. |
用不同浓度5-FU、吡柔比星、柔红霉素、长春新碱和As2O3分别作用于亲本K562细胞和K562/ADM细胞24、48和72h，计算IC50值并比较这两种细胞对以上几种化疗药物的敏感性。结果表明K562/ADM细胞对5-FU、吡柔比星、柔红霉素、长春新碱等4种化疗药物均出现明显的交叉耐药现象，但对As2O3并不出现耐药现象。相反，K562/ADM细胞对As2O3更加敏感，24 h、48 h和72 h的IC50值较K562细胞分别下降31.6%、36.3%和42.7%(Fig 2)。这也进一步说明As2O3与其他化疗药物的作用靶点不同，可用于治疗对其他化疗药物耐受或化疗后复发的白血病患者。
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| Fig 2 K562 /ADM cells resistance to other chemotherapeutic drugs(x±s, n=4) **P < 0.01 vs K562 cells. |
用透射电镜和MDC染色荧光显微镜观察发现，K562/ADM细胞内自噬体数量和MDC点块状荧光强度较K562细胞显著增多。用Western blot检测K562/ADM细胞耐药前后自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、p62的表达水平。结果表明，K562/ADM细胞内与自噬体形成有关的蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达水平较亲本K562细胞分别增加了0.78倍和6.5倍。而p62作为自噬的底物蛋白，其表达水平随着细胞自噬水平的增高反而降低(Fig 3)。这说明K562细胞对ADM耐药后细胞自噬水平较耐药前明显增强。
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| Fig 3 Comparison of autophagy level between K562 and K562/ADM cells (x±s, n=3) A: Macroautophagic vacuoles in cells were detected by transmission electron microscopy (×8 000);B: The average fluorescence intensity of MDC was analysed by fluorescence microscopy (×400);C: The expression of autophage-associated proteins in K562 and K562/ADM cells, **P < 0.01 vs K562 cells. |
用3 mmol·L-1 3-MA预处理K562/ADM细胞3 h后再用不同浓度ADM作用细胞72 h，对K562/ADM细胞的增殖抑制程度较ADM单独作用组显著增加。3-MA与ADM联合作用组的IC50为11.3 μmol·L-1，较ADM单独作用组降低了74.8%(Fig 4A)。用Annexin V/PI双染检测细胞凋亡率，3 mmol·L-1 3-MA与30 μmol·L-1ADM联合作用组的总凋亡率为41.4%，而ADM单独作用组的总凋亡率为18.5%，两者相比差异有显著性(P < 0.01)(Fig 4B，4C)。
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| Fig 4 Effect of 3-MA on sensitivity of K562/ADM cells to ADM (x±s, n=3) A: 3-MA enhanced the inhibition ratio of ADM to K562/ADM cells.B: Histogram of apoptotic ratios. C: 3-MA increased the apoptosis ratio of ADM to K562/ADM cells, **P < 0.01vs control group; △△P < 0.01 vs ADM group. |
P-gp和BCRP均可作为多种亲脂性化疗药物(如阿霉素、长春新碱、柔红霉素、吡柔比星等)的“外排泵”直接将药物泵出细胞外，避免药物对细胞造成损伤，从而导致肿瘤耐药。MRP1能够识别多种化疗药物与谷胱甘肽(GSH)形成的偶合物并将其转运出细胞[6-7]，因此，P-gp、MRP1和BCRP 3种蛋白均与肿瘤耐药有关。我们用Western blot检测K562/ADM细胞耐药前后及3 mmol·L-1 3-MA作用48 h后耐药相关蛋白P-gp、MRP1和BCRP的表达水平。结果表明，K562/ADM细胞内P-gp、MRP1和BCRP的表达水平较亲本K562细胞均显著上调，而3-MA能有效抑制K562/ADM细胞内P-gp、MRP1和BCRP蛋白的表达(Fig 5)。
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| Fig 5 Expression of resistance-associated proteins (x±s, n=3) Lane 1, K562 cells. Lane 2, K562/ADM cells. Lane 3, 3-MA treated K562/ADM cells for 48 h, **P < 0.01 vs K562 cells; ΔΔP < 0.01 vs K562/ADM cells. |
自噬是细胞在外环境刺激下，通过溶酶体降解其内部错误折叠的蛋白质、受损的细胞器等内容物而实现自我调节的复杂过程，有众多基因参与细胞自噬的调节。细胞自噬产生的物质可以供细胞重新利用，可以使细胞在十分严峻的生存条件下通过降解自身物质提供营养成分和能量从而得以生存[8]。自噬与肿瘤关系密切，在不利的肿瘤微环境中，自噬降解系统及其严密的防御体系构成了肿瘤细胞赖以生存、增殖甚至耐药和转移的基础[6, 9-10]。
白血病化疗过程中由化疗药物诱发的MDR现象往往是白血病治疗失败和复发的主要原因之一。目前关于MDR现象的确切机制尚不明确，而且至今也缺乏有效的干预措施。有文献报道证实，自噬参与胃癌、食道癌和肝癌等实体瘤的耐药性形成[11-13]。基于这些研究背景我们考虑：白血病细胞在某种化疗药物诱导下是否会产生MDR现象？耐药是否与自噬有关？在本研究中，我们通过模拟临床化疗过程，从0.02 μmol·L-1ADM开始，逐渐提高药物浓度、间歇性诱导K562细胞对ADM产生耐药并建立稳定耐受15 μmol·L-1 ADM的K562/ADM细胞，并测定该细胞对阿霉素、吡柔比星、柔红霉素、5-FU、长春新碱和As2O3的敏感性。研究发现K562/ADM细胞对吡柔比星、柔红霉素、5-FU和长春新碱均产生交叉耐药现象，而对As2O3较K562细胞更加敏感。这一方面说明K562/ADM细胞出现MDR现象, 另一方面说明As2O3在治疗白血病方面有独特优势，且没有明显的骨髓抑制和其他毒副作用。临床发现在维甲酸治疗后达到缓解的急性早幼粒细胞白血病患者中，联合使用As2O3可以巩固维甲酸的疗效，因此As2O3被认为是维甲酸的黄金搭档[14-15]。陈竺、陈赛娟等科学家通过临床试验使用As2O3对抗全反式维甲酸耐药取得了成功，这表明As2O3在抗白血病和抗耐药方面有显著的效果和独特的作用机制。因此，开发出与常规化疗药物不存在交叉耐药并能增强常规药物疗效的新型药物是攻克白血病MDR的潜在有效机制，也是我们进一步研究的方向。
阿霉素曾被认为是最有效的化疗药物之一，但近年来日趋严重的MDR现象严重制约了其临床使用，其引起MDR的机制非常复杂，主要与ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白家族有关，该家族成员P-gp、MRP1和BCRP等耐药相关蛋白能通过不同机制将化疗药物外排[16]。我们的研究发现，K562/ADM细胞通过高表达P-gp、MRP1和BCRP等蛋白将吡柔比星、柔红霉素、5-FU和长春新碱等化疗药物泵出细胞，是K562/ADM细胞出现交叉耐药的重要原因之一。此外，我们通过观察自噬形态学改变和自噬相关蛋白表达变化客观反映细胞自噬强度，发现K562/ADM细胞的基础自噬水平较亲本K562细胞显著增加，抑制自噬既能显著提高K562/ADM细胞对ADM的敏感性，促进细胞发生凋亡，也能抑制耐药相关蛋白的表达，这说明细胞自噬水平增高是K562/ADM细胞出现耐药的另一重要原因。
如今，靶向自噬也逐渐成为靶向治疗白细胞等血液肿瘤的重要机制之一，使自噬在血液系统肿瘤中的作用机制得到越来越多的研究和认识。本研究从MDR和自噬角度对K562/ADM细胞进行了初步探究，还需要进一步深入研究。相信随着科学的发展，自噬与白血病复发、自噬调控及耐药等问题将会不断得到揭示。
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