2. 宁波市医学科学研究所，浙江 宁波 315000;
3. 浙江大学医学院附属第一医院麻醉科，浙江 杭州 310002
2. Ningbo Institute of Medical Sciences, Ningbo, Zhejiang 315000, China;
3. Dept of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Zhejiang University Medical College, Hangzhou 310002, China
疼痛是与实际或潜在组织损伤相关或类似的令人不快的感觉和情感体验。疼痛的治疗包括药物、认知行为疗法、神经肌肉阻滞和电神经刺激等方法。但均存在药物副作用多、安全性差、疗效欠佳、组织损伤大等缺点[1]。然而，BTX-A因具有一次给药后相对持续的镇痛效果，有高安全性和无成瘾等优势，以及对于肌筋膜张力性疼痛、神经源性疼痛和炎症性疼痛均有较好的疗效而备受关注[2]。
1892年Kerner教授首次报道肉毒毒素(botulinum toxin，BTX)[3]。此后，根据血清型和抗原性的不同，将BTX分成7种(A、B、C、D、E、F、G)亚型[4]。其中BTX-A凭借其较高的亲和力和良好的耐受性在临床中应用广泛。2011年美国药监局将慢性偏头痛作为BTX-A唯一的临床疼痛适应症。起初人们认为松弛肌肉是疼痛缓解的主要原因，但随后的随机对照实验中发现：BTX-A在非肌肉疼痛的模型中也具有镇痛效果，且优于肌肉疼痛模型，这使得BTX-A在疼痛治疗中的作用机制更富有争议[2]。本文分别从周围神经系统和中枢神经系统两个方向讨论BTX-A在疼痛治疗中的可能机制，并将已报道的机制总结如Fig 1所示，旨在为临床实践提供参考和依据。
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| Fig 1 Schematic diagram of mechanism of botulinum toxin type A in treating pain |
BTX-A可以阻断周围感觉神经中伤害性神经递质的释放。在体外初级感觉神经元的培养中，BTX-A抑制由KCl诱发的降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P物质(substance P，SP)和谷氨酸的释放[5]。在SP和神经激肽A(neurokinin A，NKA)或神经激肽1(neurokinin 1，NK1)受体基因敲除鼠和野生型小鼠的对比实验中，BTX-A更能够缓解基因敲除鼠中福尔马林诱发的慢性疼痛和神经病变或炎症诱发的急性疼痛[6]。在福尔马林诱导的大鼠后爪和颞下颌关节疼痛的模型中，外周注射BTX-A同样可以降低组织中谷氨酸和SP的水平[7]。通过微透析测定发现：在人类皮肤皮内注射BTX-A后，皮内辣椒素和SP的释放量明显下降[8]。因此，BTX-A的机制可能是通过抑制外周伤害性神经递质的释放来介导，但目前还没有临床证据表明BTX-A的镇痛作用与该机制有直接因果关系[2]。
另外，BTX-A还可以阻断神经肌肉接头处信号递质的释放。体外实验表明，神经毒素能阻滞胆碱能突触释放乙酰胆碱，但不会干扰其合成和存储，因此能选择性的降低疼痛区域的肌张力，阻断肌肉痉挛性收缩。同时临床研究也证实BTX-A在治疗紧张性偏头痛、慢性腰痛和肌筋膜疼痛方面的功效和安全性[4]。
1.2 BTX-A的抗炎作用BTX-A的抗炎作用是存在一定争议的。动物研究中发现：在完全弗氏佐剂(complete Freunds adjuvant，CFA)或福尔马林诱导的慢性疼痛模型中，BTX-A可减轻疼痛区域的炎症性肿胀，同时促进外周谷氨酸的释放[9]。但在辣椒素或卡拉胶诱导的急性疼痛模型中，虽然BTX-A能够降低疼痛的敏感性，但在组织中未观察到肿胀相关炎性渗出液的吸收，说明镇痛与局部炎症之间是互不干涉的[10]。此外在急慢性的关节炎性疼痛的模型或病例中，关节内注射BTX-A可减轻软骨变性、降低滑膜组织中促炎细胞因子IL-1βh和TNF-α的表达，并观察到炎性细胞的浸润[11]。同时，BTX-A也能降低CFA诱导的颞下颌关节炎的痛觉过敏，明显降低外周SP、CGRP和IL-1β等细胞因子的水平，而在环磷酰胺诱导的膀胱炎和辣椒素诱导的前列腺炎的模型中，BTX-A能够促进炎性细胞积聚和环氧合酶-2的表达，加剧炎性反应[7]。以上结果说明，BTX-A对伤害性刺激的调控作用在不同疾病模型有所差异, BTX-A对慢性炎性疼痛有更直接的抗炎作用[2]。
在临床实验中：经皮下注射BTX-A后发现局部谷氨酸释放减少，同时在一组对比BTX-A和生理盐水注射前后的实验中，皮下组织活检也未发现SP、CGRP的浓度差异[8]。这一系列矛盾的研究结果，使得BTX-A通过抗炎镇痛的作用存在争议。
1.3 BTX-A对损伤神经修复的作用在慢性压迫性损伤神经病理痛的模型中，发现BTX-A能加速神经断端的生长。进一步的研究发现，在早期神经损伤的小鼠模型中注射BTX-A，可以增加细胞分裂周期2(cdc2)和生长相关蛋白43(GAP-43)的表达，促进施旺细胞的增殖和成熟[12]。最新研究：BTX-A可以在坐骨神经干内通过轴突转运的方式进入施旺细胞，改变传入神经的感觉反馈机制，减少Ia纤维的传输效率，提高镇痛的效果, 同时也观察到BTX-B可以缓解神经源性疼痛，但却不具备促进神经修复的能力，这表明BTX-A对受损伤神经内的基因表达模式有某些未知的作用，这是BTX-B所不具有的[13]。
1.4 BTX-A对感觉神经节的影响对于BTX-A在外周神经中的转运途径，最先发现：BTX-A可能从周围神经的轴突向初级传入纤维的感觉神经元进行逆向转运。进一步研究发现，BTX-A可在大脑不同脑区进行跨突触转运。这可能是BTX-A治疗经偏头痛的机制之一[2]。体外研究表明，用BTX-A处理神经胶质细胞可促进胶质细胞谷氨酸的释放，并改变胶质细胞和感觉神经元之间的突触连接方式[14]。
动物实验中：大鼠三叉神经节损伤的疼痛模型中，直接注射BTX-A可缓解三叉神经痛。这与BTX-A可降低伤害相关的离子通道蛋白(如辣椒素受体1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)和嘌呤受体P2X3)表达上调，并减少早期多肽类疼痛递质(如前强啡肽)的mRNA的转录水平有关[12, 15]。此外，Shimizu等也证明BTX-A降低了硬脑膜投射区域中感觉神经元中TRPV1的表达。在体外试验中，从三叉神经节中急性分离的初级神经元，经BTX-A处理后可阻断KCL诱发的神经胞吐过程，减少伤害性神经递质释放[16]。以上结果表明，BTX-A会阻断伤害性物质向神经节感觉神经元表面转移从而达到镇痛的作用[17]。
2 BTX-A对中枢神经系统的作用BTX-A对外周神经系统的作用有助于疼痛治疗，但就镇痛程度而言，BTX-A若只作用于外周神经和神经元是不够的，实验证实如果只作用与外周神经和神经元，最低有效剂量的镇痛时间在24 h左右，但实际作用时间可至48 h后。因此专家提出假设：BTX-A对中枢神经系统也有作用[18]。后期的研究表明，单侧BTX-A注射后双侧疼痛超敏反应均降低，其次是与局部皮下给药相比，椎管内给药后疼痛缓解更快，剂量需要更低，更进一步证实该假设[19]。
2.1 BTX-A对中枢中TRPV1表达的影响临床中发现BTX-A仅调控疼痛相关的炎症和机械刺激，不影响其感觉模式(如瘙痒)，原因可能与BTX-A选择性作用于特定的感觉神经元有关[20]。BTX-A能缓解福尔马林诱发的大鼠口面部疼痛，但该作用效果能被辣椒素反转。辣椒素会上调感觉神经元TRPV1的表达水平，阻止BTX-A在三叉神经核中对SNAP-25的裂解。这表明：表达TRPV1神经元的末端可能有抑制BTX-A活化的酶存在, 研究表明，BTX-A更容易表达在TRPV1受体的初级感觉神经元上，可能的原因是外周感觉神经元中有较高的SV2A(突触囊泡蛋白2A)蛋白表达水平，让BTX-A进入神经元发挥镇痛作用[21]。这与基础研究一致，BTX-A对临床中感觉功能保留较好的异常性疼痛患者有较好的治疗效果[22]。在TRPV1、NK1、NKA基因敲除小鼠中，BTX-A不能有效缓解神经病理痛和慢性炎性痛，这表明BTX-A可通过调节辣椒素敏感神经元而发挥镇痛作用[6, 18]。但是，在卡拉胶引起的双侧坐骨神经慢性机械性痛觉过敏的模型中，用高剂量辣椒素对坐骨神经进行脱敏后，并不影响BTX-A的镇痛作用[22]。因此，可以推测BTX-A的作用通路和相关的神经元可能不只这一项。
2.2 BTX-A对小胶质细胞和星形胶质细胞的影响小胶质细胞通过分泌谷氨酸转运蛋白-1能增强神经元传递过程中的突触长期增益效应，同时星形胶质细胞可分泌间隙连接蛋白-43促进神经元之间的间隙连接，这均可使脊髓背角神经元过度兴奋，在神经性疼痛的产生和维持中起关键作用[23]。BTX-A镇痛的作用机制可能与抑制神经胶质细胞活化度和减轻神经性炎症有关[12]。研究表明，在大鼠脊髓的背角和腹角，注射BTX-A可降低小胶质细胞和星形胶质细胞的活化程度，并抑制炎症因子IL-1β和IL-18的表达，提高了IL-1RA和IL-10在脊髓和/或背根神经节中的浓度[24]。近期的一项体外研究表明，BTX-A通过抑制p38、ERK1/2、NF-κB介导的细胞内信号通路而抑制大鼠小胶质细胞中IL-1β、IL-18、IL-6和一氧化氮合酶2的表达。此外，BTX-A可通过抑制P2X7受体促进小胶质细胞向M2型分化，从而缓解神经病理性疼痛。BTX-A还降低了SNAP-23(小胶质细胞中主要的SNAP分子)的表达，增加了TLR2(小胶质细胞的分子靶点)及其衔接蛋白MyD88的表达[25]。尽管研究的结果明确，但仍需进一步实验探索BTX-A在神经炎症机制中的作用细节。
2.3 BTX-A对中枢内源性阿片肽和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)神经传递的间接作用Drinovac等[26]研究发现，在大鼠神经病理痛模型中，BTX-A通过增强内源性阿片肽和GABA能神经递质与各自受体的结合，发挥了镇痛作用。在腹膜内或鞘内注射纳曲酮(阿片受体拮抗剂)和荷包牡丹碱(GABA受体拮抗剂)，可抑制BTX-A对疼痛的治疗治疗效果, 而脑室给药后完全不影响BTX-A抗伤害感受作用[18]。此外，在神经病理痛小鼠的模型中，观察到BTX-A和吗啡联合给药的镇痛效果优于吗啡单独给药，BTX-A降低了疼痛对吗啡的耐受性，同时增强了神经元μ-阿片受体的表达[20]。
同时临床中也证实BTX-A能有效治疗因药物滥用而出现止痛药耐受的相关疼痛。因此专家提出间接作用的观点：即BTX-A对疼痛的治疗，是调控中枢-脊髓下行抑制系统，该系统会减弱脊髓背角的伤害性感觉输入，这其中可能涉及一些尚未确定的神经环路，而不是直接抑制神经元功能产生镇痛效果[2]。
2.4 BTX-A对上行性疼痛传递途径的作用BTX-A主要在毒素注射区域相关的脊髓背角和/或脑干感觉区域起作用。视神经系统的研究表明：BTX-A类似于破伤风毒素，有跨多突触传递功能，能够在多个突触中依次发生轴突运输和胞吞作用[27]。因此，BTX-A可能通过类似的机制转送到上行的感觉区域。
有研究在大鼠胡须垫中注射BTX-A后，只在三叉神经脊尾状核和口状核中发现SNAP-25的裂解，而检查其他感觉区域(丘脑、下丘脑、感觉皮层、蓝斑、中脑导水管周围灰质等)中未发现SNAP-25的裂解。该研究表明，BTX-A在中枢神经系统内的扩散相对较小，小剂量应用时，毒素不太可能运输到较远的感觉和运动区域。然而，大剂量的BTX-A可能导致对侧感觉和运动区域SNAP-25发生裂解，支持BTX-A在脊髓逆向轴突运输假说[29]。另一研究，BTX-A可以抑制福尔马林诱发中脑导水管周围灰质和蓝斑中c-Fos的表达，但BTX-A不影响间脑其他区域c-Fos的表达[28]。这表明，在上行感觉区域的神经元受到了间接的调节。目前尚无功能成像证据支持BTX-A对上行疼痛传递的作用。
3 总结与展望BTX-A在临床疼痛治疗中有确切的疗效，特别是针对肌骨方面的疼痛，病因包括肌筋膜张力性、炎症性和神经源性。其优势在于操作简便，疗效具有可持续性。在安全范围内即便多次给药，几乎无毒副作用，无成瘾性。但在临床应用方面，BTX-A在疼痛治疗上的使用仍处于初步阶段，对于应用的指征，注射的剂量、部位和时机均未有明确的指导意见，多数的治疗以经验为主，这不仅需要临床经验的积累，更重要的是对作用机制的明确把握。然而，BTX-A在疼痛治疗中的作用机制仅明确的是：BTX-A不只作用于在单一的通路和神经元细胞，而是需要外周和/或中枢内某些介导疼痛超敏反应的神经元群和相关通路的共同作用。其作用的靶点最有可能与细胞上的某些未知受体有关，当这些靶点通过某一通路与BTX-A结合后被激活，可产生一段时间内的持续效应。同时，我们还了解到电镜下对BTX-A晶体的三维重建可被用于证实BTX-A在胃肠道上皮细胞上的作用通路和结合受体，因此通过这种神经分子工程的研究将会成为BTX-A在疼痛治疗中探索相关作用靶点的新模式。
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