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高华(1962-),女,博士,教授,博士生导师,研究方向:药检药理学,通讯作者,E-mail:huag55@163.com
单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A,MPLA)佐剂是一种较常见的免疫佐剂,应用于多种疫苗之中[1-2],如人乳头瘤病毒(HPV)16型和18型疫苗(商品名Cervarix)。作为疫苗的成分之一,应进行热原(细菌内毒素)检测以控制其自身质量。MPLA有多种生产方法,包括合成法或提取自明尼苏达沙门氏菌R595,生产过程中需要对细菌内毒素等污染物进行严格控制。目前国内罕见针对广泛应用的MPLA佐剂进行热原控制的技术方法报道。
细菌内毒素检查法和热原检查法是《中国药典》(2015版)[3]中收载的用于检测注射剂热原污染的方法,一般品种热原控制首选细菌内毒素检测。家兔热原检查法由于使用实验动物,并且只能定性检测无法定量给出具体数值,可作为终产品放行方法,但对生产过程中质量控制意义较小。新的体外热原检测方法[4-5](单核细胞活化实验)是根据人的发热机理而设计的一类检测方法,报告基因法本质是对单核细胞活化实验的改良。通过引入报告基因而简化实验流程。
本研究选择了人源高表达TLR2受体的HEK细胞系和人源高表达TLR4受体的HEK细胞系进行检测,并选择了细菌内毒素检查法作对照研究。参照药典要求[6]3种方法分别进行线性与范围、专属性、检测限、耐用度、回收率等方法学研究,其中以专属性为研究重点。以期为MPLA佐剂建立适宜的热原质量控制方法。
1 材料与方法 1.1 主要试剂细菌内毒素国家标准品(批号:150800-201601)中国食品药品检定研究院提供;动态显色法试剂盒(货号:KC-125,批号:1611182)购自湛江安度斯生物有限公司;人源高表达TLR2受体的HEK细胞系(货号:hkb-htlr2)购自美国InvivoGen公司;人源高表达TLR4受体的HEK细胞系(货号:hkb-htlr4)购自美国InvivoGen公司;合成MPLA分别购买自sigma(货号:5086PHB029,批号:69800P-5mg-B-029)和InvivoGen公司(货号:tlrl-mpls,批号:MPS-40-02)。
1.2 线性和范围 1.2.1 细菌内毒素检查法标准曲线制备:用1 mL细菌内毒素检查用水(BET水)溶解细菌内毒素标准品,混匀15 min后,稀释制备标准内毒素溶液,每步稀释混匀不少于30 s;标准曲线范围100~104 EU·L-1,稀释梯度为10(本文中标准曲线均为10倍稀释)。阴性对照制备:将内毒素标准品溶液加入酶标板,每个浓度设3个复孔,阴性对照设2个复孔,加样量均为100 μL每孔,于37 ℃孵育10 min;将鲎试剂按标示量1.25 mL溶解,立即加入酶标板中,每孔100 μL, 振荡10 s;于37 ℃条件下孵育,于660 nm处每隔30 s读取一次数据,预设OD值为0.02。实验重复5次。
1.2.2 人源高表达TLR2受体的HEK细胞系当细胞覆盖率达到50%~80%时,经悬浮细胞计数后,用培养基将细胞稀释2×108个·L-1,接种到96孔板,每孔160 μL。用1 mL细菌内毒素检查用水(BET水)溶解细菌内毒素标准品,混匀15 min后,稀释制备标准内毒素溶液,标准曲线范围100~104 EU·L-1每个浓度平行3孔。在酶标板中每孔加入20 μL内毒素标准溶液,再加入20 μL的BET水。培养24 h后每孔吸取上清液20 μL至一个新酶标板中,每孔续加180 μL专用显色溶液,37 ℃孵育3 h,显色为蓝紫色,在波长630 nm下检测。实验重复5次。
1.2.3 人源高表达TLR4受体的HEK细胞系除采用细胞系为人源高表达TLR4受体的HEK细胞系,其余操作同1.2.2。实验重复5次。
1.3 专属性研究MPLA与鲎试剂的反应:取商业化生产的两批MPLA分别稀释至1 μg·L-1与鲎试剂进行反应。人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系:取商业化生产的两批MPLA分别稀释至1~10 000 μg·L-1分别与人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系进行反应,记录每一浓度响应值(OD值)。另取细菌内毒素标准品,使用内毒素检查用水,稀释至100~106 EU·L-1,分别使用人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系进行反应,记录每一浓度的响应值(OD值)。
1.4 最低检测限 1.4.1 细菌内毒素检查法最低检测限为鲎试剂标识灵敏度的下限。
1.4.2 人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系最低检测限为所制备的细菌内毒素标准曲线(S型四参数拟合曲线)的最低点浓度, 该检测限所至单核细胞分泌的内热原量应不小于阈值(阴性对照的平均值加上其3倍的标准偏差);若小于阈值,则将阈值对应的OD值代入上述四参数拟合曲线中,获得的浓度值即为最低检测限。
1.5 耐用度研究人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系:考察细胞代次的对实验影响,将细胞传至20代。按照1.2.2标准曲线线性和范围实验进行操作,r值应大于0.980。检测限不应降低。
1.6 回收率实验 1.6.1 内毒素检查法样品制备:将2种不同来源的MPLA用细菌内毒素检查用水进行系列稀释,细菌内毒素检查法中,2批样品在1 μg·L-1测定。样品阳性对照制备:用内毒素检查用水将细菌内毒素国家标准品进行系列稀释,每步稀释混匀不少于30 s;将内毒素标准品分别加入到2批MPLA中,使其含有内毒素含量为104 EU·L-1。标准曲线制备:用1 mL细菌内毒素检查用水(BET水)溶解细菌内毒素标准品,混匀15 min后,稀释制备标准内毒素溶液,标准曲线范围100~106 EU·L-1,每个浓度平行3孔。阴性对照制备:为内毒素检查用水。
1.6.2 人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系样品制备:将2种不同来源的MPLA用细菌内毒素检查用水进行系列稀释,TLR4细胞系中,2批样品在1 mg·L-1测定。TLR2细胞系中,2批样品在0.1 g·L-1测定。样品阳性对照制备同1.6.1。标准曲线制备:用1 mL细菌内毒素检查用水(BET水)溶解细菌内毒素标准品,混匀15 min后,稀释制备标准内毒素溶液,标准曲线范围100~ 106 EU·L-1每个浓度平行3孔。阴性对照制备:为内毒素检查用水。
1.7 内毒素含量检测样品制备、样品阳性对照制备、标准曲线制备、阴性对照制备同1.6回收率试验。
1.8 统计方法 1.8.1 细菌内毒素检查法到达预设OD值的时间(Onset time)与对应的内毒素浓度进行双对数转换,以内毒素浓度对数值为横坐标,以Onset time对数值为纵坐标进行线性拟合,拟合相关系数的绝对值应大于0.980。
按中国药典内毒素检查法干扰实验项目下计算回收率,回收率在50%~200 %范围内有效。
1.8.2 人源高表达TLR2/TLR4受体的HEK细胞系以内毒素浓度值为横坐标,以吸光度值为纵坐标进行四参数拟合,拟合相关系数应大于0.980。按中国药典内毒素检查法干扰实验项目下计算回收率,回收率在50%~200 %范围内有效。
2 结果 2.1 线性和范围采用3种方法进行检测,r的绝对值均> 0.980,检测范围上下限及r的绝对值,详见Tab 1。
Method | linear range/EU·L-1 | |r| | |||
Minimum detectable limit | Maximum detectable limit | Averagevalue | RSD/% | ||
Bacterial endotoxin test | 1 | 103 | 0.999 | 0.000 55 | |
TLR2 cell line test | 100 | 106 | 1.000 | 0.000 00 | |
TLR4 cell line test | 100 | 106 | 0.999 | 0.000 55 |
MPLA与鲎试剂反应方面,MPLA可以引起类似内毒素的响应,其响应值高达1×109 EU·g-1水平,与纯品细菌内毒素的反应水平相当(参照细菌内毒素国际标准品说明书),应为假阳性结果。MPLA专属性研究试验结果方面,MPLA对TLR2细胞系在实验浓度范围内测定值与阴性对照均无显著性差异,表明在该浓度范围内,MPLA并不会与TLR2细胞系发生反应,详见Fig 1。MPLA在1 mg·L-1以上可激动TLR4受体并产生效应。此即MPLA的免疫激活效应,详见Fig 2。内毒素专属性研究结果方面,不同纯度内毒素在不同浓度表现出对TLR2/TLR4细胞刺激结果不同。TLR2细胞对内毒素标准品在10 000~106 EU·L-1范围内显示出随浓度依赖的响应,详见Fig 3。对于TLR4细胞内毒素标准品在浓度100~106 EU·L-1范围内细胞显示出随剂量依赖的响应,详见Fig 4。综上所述,MPL和内毒素标准品,对鲎试剂和TLR4细胞系引起类似的响应活性,不能将两者区分;而TLR2细胞系仅对细菌内毒素标准品有响应,因此可用TLR2细胞系作为MPL的检测细胞。
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Fig 1 Results of MPLA specificity test on TLR2 cell line (x±s, n=3) |
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Fig 2 Results of MPLA specificity test on TLR4 cell line (x±s, n=3) *P < 0. 05, **P < 0. 01 vs control group |
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Fig 3 Results of endotoxin specificity test on TLR2 cell line (x±s, n=3) *P < 0. 05, **P < 0. 01 vs control group |
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Fig 4 Results of endotoxin specificity test on TLR4 cell line (x±s, n=3) *P < 0. 05, **P < 0. 01 vs control group |
根据“1.4.1”和“1.4.2”,内毒素检查法检测限确定为10 EU·L-1,TLR2细胞法为104 EU·L-1,TLR4细胞法为100 EU·L-1。
2.4 耐用度考察细胞传代次数对实验影响,TLR2/TLR细胞系传至20代,按照“1.2.2”标准曲线线性和范围实验进行操作,r值均大于0.980。各自检测限与“2.3项”相比,均未降低。
2.5 回收率实验和内毒素检测结果结果见Tab 2。根据药典规定,回收率在50%~200 %即符合规定,其检测值即为样品的内毒素含量。
Method | Lot number | ||||
69800P-5 mg-B-029 | MPS-40-02 | ||||
Value/EU·g-1 | Recovery/% | Value/EU·g-1 | Recovery/% | ||
Bacterial endotoxin test | 1×109 | 112 | 1×109 | 105 | |
TLR2 cell line test | < 105 | 90 | < 105 | 93 | |
TLR4 cell line test | 3.5×106 | 87 | 4.6×106 | 130 |
实验结果显示,MPLA和细菌内毒素都能与鲎试剂发生反应。细菌内毒素一般由3部分组成,类脂A核心多糖和特异性多糖,鲎试剂与细菌内毒素的结合位点在于类脂A部分[7]。而MPLA恰恰是人工合成的类脂A结构类似物。虽然其具有相同的结合位点,但是其与鲎试剂的反应剂量依赖性却与细菌内毒素表现出很大差异,由于这种特性,类似于生物测定量反应平行线法测定中,样品与标准品产生的生物活性不同,不能用来定量。另一方面,细菌内毒素检测的目的是间接反映样品中污染的热原量,MPLA虽然能与鲎试剂发生反应,然而却不具有致热性[8],这就使得使用鲎试剂这种方法来控制其热原污染程度失去了意义。因此表 2中细菌内毒素检查法所测定结果,虽然回收率实验符合药典的规定,用来量化细菌内毒素并不准确,仅作为同浓度不同样品间内毒素含量比较参考值。
TLR4细胞法专属性结果与细菌内毒素检测专属性研究结果类似。同样存在无法确定检测值是由MPLA引起还是由于细菌内毒素引起,因此也不适合用来量化细菌内毒素含量。根据中国药典规定,细菌内毒素检查法在检测过程中,仅需要进行标准曲线可靠性验证和干扰试验,即回收率,可建立检测方法。并不进行专属性、耐用度等方面的研究。然而根据研究结果显示,MPLA会严重干扰细菌内毒素检测和TLR4细胞法准确检测出细菌内毒素。
根据Fig 2、4结果,虽然MPLA和内毒素均能够激动TLR4受体,根据细菌内毒素国际标准品的内毒素质量和效价关系,0.12 ng对应1 EU效价,可估算0.012 μg·L-1即可激活TLR4受体,明显高于MPLA(1 mg·L-1)。推测与细菌内毒素的分子大小与聚集形态更适合于结合TLR4受体。
细菌内毒素是经典的TLR4受体激动剂[9],本实验表明细菌内毒素国家标准品同样可以激活TLR2受体。根据文献报道[10-11],细菌中的脂蛋白,或者热灭活大肠杆菌均可以激活TLR2受体,即使TLR2受体是由非内毒素成分激活,本研究所建立的TLR2细胞检测体系仍然可以用于质控,其原因在于自然界不存在细菌内毒素纯品,在质量控制活动中出现的细菌内毒素必定为细菌死亡后的产物。TLR2细胞检测体系即为检测微生物污染间接反映热原的量。
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