2. 台州中西医结合医院神经内科, 浙江 台州 317200;
3. 浙江大学医学院附属第二医院, 浙江 杭州 310009
2. Dept of Neurology, Taizhou Integrated Chinese and Western Medicine Hospital, Taizhou Zhejiang 317200, China;
3. Dept of Pharmacy, The Second Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310009, China
神经母细胞瘤(neuroblastoma, NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子, 参与多种肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤转移, 并能预测部分肿瘤患者的预后情况[4]。针对Oncomine肿瘤数据库NB肿瘤组织的生物信息学分析发现, TAZ基因在NB肿瘤组织中呈高表达, 且随着NB的恶化, 表达逐渐升高。而TAZ是否参与NB的形成及恶化尚未完全明确。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人NB细胞株SH-SY5Y由浙江大学药学院陈忠教授惠赠; 慢病毒包装细胞293T购自于ATCC细胞库。
1.1.2 试剂KOD Plus NEO高保真酶购自Toyobo公司; G418、嘌呤霉素和强力霉素(DOX)购自Sigma公司; 实时定量PCR试剂盒购自宝生物公司。
1.1.3 仪器凝胶电泳、qPCR分析仪和Western blot系统(Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 pLVX-TRE3G-TAZ质粒的构建通过设计无缝克隆TAZ引物(Tab 1), KOD Plus NEO高保真酶扩增TAZ序列。无缝连接至诱导过表达载体pLVX-TRE3G。连接产物经DH5α感受态转化、涂板和氨苄抗性筛选, 挑选克隆进行菌液PCR, 阳性进一步送测序, 测序结果通过DNAMAN软件进行比对。
| Primer | Sequence(5’→3’) | Product/bp |
| TAZ-F | TTTTGTCTTATACTTGGATCCATGAATCCGGCCTCGGCG | 1233 |
| TAZ-R | AGAGAATTCCATATGACGCGTTTACAGCCAGGTTAGAAAGGGC |
将pLVX-TRE3G-TAZ及pLVX-Tet3G分别与慢病毒包装质粒sPax、VSVG共转293T细胞, 制备慢病毒LV-TAZ OE和LV-control用于感染SH-SY5Y细胞, 48 h后加入G418(300 mg·L-1)和嘌呤霉素(1 mg·L-1)筛选96 h, 获得稳定生长的SH-SY5Y细胞系。
1.2.3 TAZ表达水平的验证给予上述获得细胞系添加DOX(200 μg·L-1)诱导48 h, 通过设计TAZ定量检测引物(Tab 2), 利用实时定量PCR和Western blot实验分别对该细胞TAZ的mRNA和蛋白表达水平进行验证。
| Primer | Sequence(5’→3’) | Product/bp |
| β-actin-F | CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC | 256 |
| β-actin-R | TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT | |
| TAZ-F | TCCCAGCCAAATCTCGTGATG | 122 |
| TAZ-R | AGCGCATTGGGCATACTCAT |
为构建TAZ条件性过表达慢病毒质粒, 利用高保真酶扩增获得1233 bp的TAZ目的片段, 将其连接至BamHI/MluI双酶切的pLVX-TRE3G载体, 连接产物经挑取相应克隆, 经PCR鉴定阳性后, 进一步测序比对分析, 表明成功获得诱导性过表达TAZ质粒pLVX-TRE3G-TAZ。
2.2 诱导性过表达TAZ的SH-SY5Y细胞株的建立和验证利用上述构建pLVX-TRE3G-TAZ包装慢病毒LV-TAZ OE感染SH-SY5Y, 经抗生素筛选获得稳定的细胞株。qPCR实验表明, LV-TAZ OE组细胞, 在DOX诱导48 h后, 其TAZ的mRNA水平是对照组的10倍(P < 0.01)。与此类似, Western blot实验发现, DOX诱导后LV-TAZ OE组SH-SY5Y细胞TAZ蛋白含量显著增多。上述结果表明, 我们成功获得可诱导TAZ过表达的SH-SY5Y细胞株。
3 讨论HIPPO信号参与肿瘤各种生物学行为是近年的研究热点, 其关键下游转录共激活因子TAZ是调控细胞增殖和凋亡、组织再生、器官大小的关键因子, 是多种肿瘤发生、发展相关的潜在靶向标记物[5]。本研究通过将TAZ克隆到诱导性过表达慢病毒载体pLVX-TRE3G并制备慢病毒感染SH-SY5Y成功获得条件性诱导过表达TAZ的SH-SY5Y细胞, 为后续进一步深入研究TAZ是否参与NB的形成及恶化提供了关键的材料。
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| [2] |
Kamihara J, Bourdeaut F, Foulkes W D, et al. Retinoblastoma and neuroblastoma predisposition and surveillance[J]. Clin Cancer Res, 2017, 23(13). |
| [3] |
于梦迪, 王明霞, 王海东. 姜黄素逆转非小细胞肺癌分子靶向药物耐药的研究进展[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(12): 1633-7. Yu M D, Wang M X, Wang H D. Research progress of reversion molecular targeted drug resistance in non-small cell lung cancer by curcumin[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(12): 1633-7. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2017.12.002 |
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Harvey K F, Zhang X, Thomas D M. The Hippo pathway and human cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2013, 13(4): 246-57. doi:10.1038/nrc3458 |
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