缺血性脑血管病的高发病率、高致残率严重影响千万患者的生命健康, 但改善脑供血同时带来的脑缺血/再灌注损伤也成为缺血性脑血管病治疗的难题之一。血管内皮损伤是缺血/再灌注损伤的关键环节。氧化应激是缺血/再灌注损伤的一个主要因素[1]。核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2, Nrf2)/血红素加氧酶-1(heme oxygenase, HO-1)信号轴具有抗氧化、抗炎、减少线粒体损伤、调控细胞死亡等作用, 是迄今为止发现的最重要的内源性抗氧化应激通路。因此, 有效调控Nrf2/HO-1信号通路现已成为治疗氧化应激性疾病的重要靶点[2]。
塞络通(sailuotong, SLT)是由本研究室、神威药业有限公司及澳大利亚西悉尼大学3方合作共同研制的中药6类新药, 主要由人参、银杏叶、西红花中药有效组分配伍而成, 功能为益气活血、化瘀通络, 用于治疗血管性痴呆和缺血性中风恢复期(气虚血瘀证)。本研究在体外模拟缺血/再灌注损伤模型, 建立人脑微血管内皮细胞系(human brain microvascular endothelial cell line, hCMEC/D3)氧葡萄糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)损伤模型, 探讨SLT对OGD/R诱导hCMEC/D3细胞损伤的抗氧化保护作用及靶点。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂塞络通(sailuotong, SLT)由神威药业集团提供, 批号090914; ML385购自Selleck公司(S8790);内皮细胞培养基(Endothelial Cell Medium, ECM)、添加剂、胎牛血清、双抗(青霉素/链霉素, P/S)均购自上海赛百慷生物技术股份有限公司, PriMed-iCell-0016;细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)购自上海东仁化学科技有限公司(CK04);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、微量还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)测定试剂盒测定均购自南京建成生物工程研究所(A001-3, A006-2);人源HO-1ELISA试剂盒购自美国abcam(ab207621);HO-1小鼠单克隆抗体购自proteintech(66743-1-Ig); Nrf2小鼠单克隆抗体购自美国abcam(ab89443)。
1.1.2 仪器Olympus SH1倒置显微镜(美国奥林帕斯公司); SYNERGYTM 4多功能酶标仪(BioTek, USA); MCO175 CO2培养箱(Sanyo, 日本); 转移电泳槽(Mini Trans-Blot Transfer Cell, Bio-Rad, USA); 垂直板电泳槽(Mini Protean3 Cell, Bio-Rad, USA); Chem DocTM XRS+凝胶成像仪(Bio-Rad, USA)。
1.2 方法 1.2.1 药物配制SLT用DMSO溶解, 配制成100 g·L-1的母液, -20 ℃保存; ML385用DMSO溶解, 配制成5m mol·L-1的母液, -20 ℃保存。处理组用等体积的DMSO作对照。
1.2.2 细胞培养复苏冻存的永生化人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)(上海赛百慷生物技术股份有限公司提供), 迅速置于37 ℃水浴锅中溶化, 加入6 mL内皮细胞完全培养基(内含5%胎牛血清+1%ECGS+1%双抗), 置于37 ℃, 5%CO2培养箱中培养。每2天更换1次培养液。当细胞处于对数生长期且待细胞生长融合达80%~90%时, 按1 : 3比例进行传代。
1.2.3 OGD/R诱导hCMEC/D3细胞损伤模型[3]弃去培养液, PBS洗2遍, 换成无糖DMEM或含有相应浓度药物的无糖DMEM, 将96孔板放入自制缺氧盒内或采用不通气的T25 cm2培养瓶, 通95%N2-5%CO2混合气, 流速1 L·min-1, 通气15 min后, 夹闭缺氧盒进气管和出气管或关紧培养瓶盖, 分别缺氧2, 4, 6 h后, 换成正常内皮细胞培养液, 复氧2 h, 进行细胞损伤模型条件的筛选。
1.2.4 CCK8法检测细胞活力取对数生长期hCMEC/D3细胞, 以0.5×107个·L-1细胞密度接种于96孔板中, 处理后, 每孔加入稀释的CCK8溶液100 μL(1 : 10 ECM培养基), 培养箱内孵育2 h, 酶标仪450 nm波长检测OD值。
1.2.5 WST-1法测定SOD活力按照试剂盒说明进行操作, 设定对照孔、对照空白孔、测定孔及测定空白孔, 进行各试剂的添加混匀后, 37 ℃孵育20 min, 450 nm处酶标仪读数。
1.2.6 微量酶标法测定GSH含量按照试剂盒说明进行操作, 取破碎后的细胞悬液0.1 mL, 加0.1 mL试剂一混匀, 3500 r·min-1, 离心10 min, 去上清液待测。设定空白孔、标准孔及测定孔, 进行各试剂的添加混匀后, 静置5 min, 405 nm处, 酶标仪测定各孔吸光度值。
1.2.7 ELISA检测细胞上清HO-1含量标准品按照试剂盒说明书提供的稀释方式稀释, 1 500 ng·L-1作为标准曲线最高浓度, 依次做2倍稀释。分别对应加入50 μL的标准品和样本, 再向每孔加入50 μL生物素标记的检测抗体复合物及100 μL 3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺TMB底物, 摇床, 清洗, 最后加入终止液450 nm处上机检测。
1.2.8 Western blot实验配制10%分离胶, 将提取hCMEC/D3细胞蛋白样品按20 μg进行上样。蛋白经电泳及转膜结束后, 放置摇床上室温封闭60 min。封闭后放置一抗中:mouse anti-HO-1(1 : 1 000)、mouse anti-Nrf2(1 : 1 000)、mouse anti-βactin (1 : 1 000), 4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜5次, 每次10 min。5%脱脂奶粉封闭液再次封闭30 min, 按1 : 20 000加入羊抗鼠二抗, 室温孵育90 min后, TBST洗膜5次, 每次10 min, 采用化学发光法, 凝胶成像仪中显影。蛋白条带用Image Lab软件自动分析。
1.3 统计方法数据统计分析用SPSS16.0软件进行统计, 多组间比较用单因素方差(One-Way ANOVA)分析, 根据方差齐性检验(Homogeneity of variance test), 分别选用LSD检验或Tamhane’s检验, 数据以均数±标准差(x±s, n≥3)表示。
2 结果 2.1 SLT对正常培养hCMEC/D3细胞活力的影响细胞在正常培养状态下, 给与不同浓度SLT处理24h, 如Fig 1所示, 与对照组比较, 6.25、12.5 mg·L-1 SLT对细胞活力无明显影响, 25、50、100 mg·L-1 SLT对细胞活力具有升高作用, 差异有显著性(P < 0.01)见Fig 1。
2.2 OGD/R不同时间点对hCMEC/D3细胞的损伤影响分别观察OGD2h/R2h、OGD4h/R2h、OGD6h/R2h对hCMEC/D3细胞损伤程度, 与对照组比较, OGD2h/R2h、OGD4h/R2h、OGD6h/R2h细胞明显损伤(P < 0.01);与OGD2h/R2h比较, OGD4h/R2h和OGD6h/R2h细胞明显损伤(P < 0.01)(Fig 2)。
2.3 SLT对OGD/R损伤hCMEC/D3细胞保护作用OGD2h/R2h、OGD4h/R2h, SLT分别在6.25、12.5 mg·L-1剂量下, 可明显增加细胞活力(P<0.01)。OGD4h/R2h, SLT可明显提高细胞SOD活力(P < 0.01)。表明SLT具有明显细胞保护作用(Fig 3)。
2.4 Nrf2抑制剂对SLT抗氧化损伤的干预作用给与Nrf2抑制剂ML385(0.25 μm)干预, 细胞活力较模型组明显降低(P < 0.01);且明显降低SLT对细胞活力的保护作用(P < 0.01)(Fig 4A)。与对照组比较, OGD/R4h/2h后HO-1含量明显增加(P < 0.05), ML385干预后, 明显降低HO-1含量(P < 0.05);与模型组比较, SLT(6.25 mg·L-1)明显提高HO-1含量(P < 0.05);ML385干预后, 明显降低SLT增加HO-1含量作用(P < 0.01)(Fig 4B)。与对照比较, OGD/R4h/2h后SOD活力、GSH含量明显降低(P < 0.01);与模型组比较, SLT(6.25 mg·L-1)明显提高SOD活力、GSH含量(P < 0.01);ML385干预后, 明显降低SLT对细胞抗氧化保护作用(P < 0.05, P < 0.01)(Fig 4C, D)。
2.5 SLT对OGD/R损伤hCMEC/D3细胞Nrf2/HO-1通路的影响与对照组比较, OGD/R4h/2h后HO-1、Nrf2蛋白表达相对值明显增加(P < 0.01), Nrf2抑制剂ML385干预后, HO-1、Nrf2蛋白表达相对明显降低(P < 0.05, P < 0.01)。与模型组比较, SLT组(6.25 mg·L-1)HO-1、Nrf2蛋白表达相对增加(P < 0.05);ML385干预后, 明显降低SLT增加HO-1、Nrf2蛋白表达作用(P < 0.01)(Fig 5)。
3 讨论缺血/缺氧性脑血管疾病发生、发展的关键环节与内皮的损伤密切相关。脑微血管内皮细胞是内覆于血管腔表面的连续单层扁平细胞, 具有合成、分泌、代谢等多种功能, 并能控制血液和脑组织之间的物质交换从而维持大脑的动态平衡[4]。脑缺血/再灌注时产生大量氧自由基使内皮细胞激活并表达多种炎症因子, 导致细胞的损伤、凋亡和坏死。hCMEC/D3细胞是永生化人脑微血管内皮细胞系, 其具备人脑内皮的大部分形态和功能特征[5]。
中医认为“气虚身中卒至, 五脏绝闭, 脉道气血不通”, 故调理气血是治疗脑中风的关键环节。在缺血性脑卒中中以Nrf2介导的氧化还原系统在某种程度上反映了气血脉失和病机特点。故本实验采用“益气活血、化瘀通络”临床有效方剂SLT以“脉”(脑微血管内皮细胞)为载体从微观层面对Nrf2介导的抗氧化通路进行干预研究。本实验室前期研究证明在双侧颈动脉结扎大鼠慢性脑低灌注模型上, SLT可明显增加SOD活性及丙二醇(malondialdehyde, MDA)含量, 具有增强清除自由基能力[6]。因此, 本研究通过建立hCMEC/D3细胞OGD/R损伤模型, 探讨塞络通对hCMEC/D3细胞的抗氧化护作用机制。通过对OGD损伤时间条件的摸索发现在缺氧4 h后, 再延长缺氧时间, 细胞的损伤并不显著升高, 故主要选择4 h作为后续实验的缺氧时间, 同时因为缺氧2 h也对细胞造成了损伤, 且程度较轻, 可以作为较轻的损伤模型, 故在部分后续实验中, 也对这种较轻模型中药物的作用进行了探讨。在OGD模型下, 最初选择了6.25、12.5、25 mg·L-1等浓度进行观察, 发现与6.25 mg·L-1比较, 12.5和25 mg·L-1并没有显示出明显的药效增加(数据未显示), 故以“同等作用下, 选择较低剂量”的原则, 在本实验中主要选择了6.25 mg·L-1作为后期药效及机制探讨的剂量。实验结果证明, OGD/R可诱导hCMEC/D3细胞损伤, SLT具有明显的细胞保护作用, 可以明显的改善细胞活力及SOD活力。
缺血性脑卒中病理机制复杂, 氧化应激是缺血性脑卒中病理过程中的一个重要因素。其中SOD活力的高低可间接反映机体清除氧自由基的能力, GSH是机体内最重要的非酶性抗氧化物, 可清除氧自由基, 故GSH亦是衡量机体抗氧化能力大小的重要物质。前期实验研究证明SLT对H2O2诱导的EA.hy926氧化应激损伤可减低ROS生成, 增加SOD活性, 通过抑制caspase-3、降低Bax/Bcl-2蛋白表达抑制细胞凋亡进而发挥对氧化损伤的保护作用[7]。本研究发现, OGD/R损伤后引起hCMEC/D3细胞SOD活力及GSH含量明显降低, SLT可以明显提高二者的含量, 进一步说明SLT具有明确的抗氧化保护能力。既往研究证实, 银杏叶提取物(ginkgo biloba extracrion, GBE)和人参皂苷(ginsenoside)可介导Nrf2/ARE信号通路发挥抗氧化应激脑保护作用。同时, 本实验结果证明在Nrf2抑制剂ML385干预下, SLT抗氧化能力被抑制, 细胞活力、SOD和GSH含量显著降低, 说明SLT可能通过Nrf2信号通路发挥抗氧化保护作用。
Nrf2/HO-1信号通路是体内的一种重要内源性的抗氧化系统。其中Nrf2属于CNC亮氨酸拉链核转录激活因子家族中活性最强的转录调节因子。在生理状态下, Nrf2与其负调控因子Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-likeECH-associated protein, keap1)双甘酸重复DGR区域结合于细胞质中, 在keap1功能结构域BTB和IVR区参与下经Cul3/Rbx1 E3泛素化降解以保持浓度稳定。在细胞遭受氧化应激刺激时, Nrf2与keap1解偶联, 易位至细胞核中, 与其下游靶基因抗氧化反应原件(antioxidant response element, ARE)结合, 调控Ⅱ相解毒酶、SOD、过氧化氢酶(catalase, CAT)等靶基因活性, 以清除ROS等有害物质[8]。最近有证据表明, 在大鼠脑缺血/再灌注损伤模型中Nrf2表达迅速上调, 而随着再灌注时间的延长, Nrf2蛋白的表达变化不明显, 这是一种保护性应激反应, Nrf2过度活化可以减轻脑缺血损伤引起的氧化损伤, 但是反应持续时间短, 需要药物进行干预缺血/再灌注损伤[9-10]。对SH-SY5Y细胞进行Nrf2 siRNA处理, 发现HO-1蛋白表达消失, 表明HO-1的表达依赖于Nrf2[11]。HO-1是Ⅱ相解毒酶之一, HO-1所引发的下级信号通路对多脏器具有抗氧化应激的保护作用。HO-1通常在除脾脏之外的大多数组织/器官中以低水平表达, 然而, 它对于保护细胞免受氧化和炎症损伤的各种刺激具有高度诱导性[12]。HO-1是Nrf2的靶抗氧化酶, 在缺血性脑疾病中有重要保护作用[13]。在本研究中, OGD/R后的hCMEC/D3细胞上清液中的HO-1含量及细胞Nrf2、HO-1蛋白表达水平相对于对照组增加, 其可能与氧糖剥夺后的应激状态下机体自身的代偿性保护机制有关, 进而激活Nrf2及下游抗氧化酶。该实验结果与前人研究相一致, 既往体内及体外实验证明了大鼠局灶性脑缺血[9, 10, 14]和PC12氧糖剥夺后[14]及H2O2诱导的RAW264.7细胞损伤均可上调Nrf2和HO-1蛋白表达[15]。
本研究发现SLT可以明显增加OGD/R损伤后细胞Nrf2和HO-1的蛋白表达, 给与Nrf2抑制剂ML385, 发现SLT对hCMEC/D3的抗氧化保护作用被ML385部分或完全减弱, 表明SLT在OGD/R损伤hCMEC/D3模型中发挥细胞保护作用可能是通过Nrf2/HO-1信号通路介导。
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