2. 安徽医科大学第二临床医学院, 安徽 合肥 230032;
3. 安徽中医药高等专科学校药学系;
4. 安徽中医药高等专科学校基础教学部, 安徽 芜湖 241000
2. The Second School of Medicine, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. Pharmacy Department, Anhui College of Traditional Chinese Medicine;
4. Basic Teaching Dept, Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Wu hu Anhui 241000, China
围绝经期抑郁症(perimenopausal depression disorder, PDD)是女性抑郁症中的常见的一种类型, 特指首次发病于围绝经期(从卵巢功能开始衰退到绝经后一年时期), 同时伴有紧张焦虑、情绪低落和认知错乱等症状, 严重者甚至会出现自杀倾向[1-2]。
近年来有研究报道[3], 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)炎性小体参与神经系统多种疾病的发病过程, 如脑损伤、癫痫等。NLRP3炎性小体的组成包括凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、NLRP3及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)3部分[4]。在外界信号刺激下, NLRP3蛋白通过其N端的热蛋白结构域, 与接头蛋白ASC的热蛋白结构域结合, 募集pro-caspase-1发生剪切, 从而激活caspase-1。激活后的Caspase-1介导白细胞介素-1β前体(pro-IL-1β)和白介素细胞18前体(pro-IL-18)切割活化成IL-1β和IL-18, 进而介导下游炎症发生[5]。
白杨素(chrysin, CHR)存在于自然界多种植物、蜂胶和蜂蜜中, 具有抗氧化、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等多种药理学活性[6-7]。本实验拟通过慢性不可预激性刺激(chronic unpredicted mild stress, CUMS)和双侧卵巢摘除(ovariectomy, OVX)两步法建立围绝经期抑郁大鼠模型, 观察海马神经元的损伤情况和检测NLRP3炎性小体各蛋白表达水平, 以及研究白杨素对模型大鼠是否具有改善作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物健康SD、SPF级, ♀大鼠, 由合肥市蜀山区史文斯实验用品销售部提供, 体质量(230~250) g。于(22±3) ℃、40%~70%湿度范围下饲养, 12 h明/暗交替。
1.1.2 药物与试剂IL-1β一抗、caspase-1一抗、NLRP3一抗、IL-18一抗(英国Abcam公司); 白杨素、ASC一抗、IL-6一抗(北京博奥森公司); β-actin多克隆抗体、辣根过氧化酶标记山羊抗兔和山羊抗鼠IgG(北京中杉金桥公司); 多聚甲醛(天津市大茂化学试剂厂)
1.1.3 主要仪器超速低温离心机(德国Sigma公司); Heal Force NW超纯水系统(Heal Force Bio-Meditech Holding Limited); 电泳仪(美国Bio Rad公司); 转移电泳槽(美国Bio Rad公司); 脱色摇床(北京六一仪器厂); MD-MIN迷你金属浴(美国Major Science公司)
1.2 方法 1.2.1 实验分组随机将SD大鼠随机分成5组, 空白对照组、模型组、CHR组(20、40、80 mg·kg-1)。空白对照组灌胃等体积生理盐水, 模型组大鼠于各种刺激后不给予任何治疗, CHR保护组于刺激后1 h分别灌胃给予不同浓度的CHR进行治疗, 持续5周。随后处死, 取脑组织待检。
1.2.2 OVX和CUMS围绝经期抑郁模型的建立SD大鼠进入动物房适应3 d后, 摘除双侧卵巢, 完成实验后单笼饲养1周。将已双侧摘除卵巢的大鼠随机分为5组, 每天早晨8点开始慢性应激实验, 除空白对照组以外, 模型组、CHR保护组每天随机接受一种应激刺激, 持续5周, 整个实验周期为六周。除慢性应激刺激时期外, 所有大鼠自由饮水进食。刺激方式为断水12 h、断粮12 h、笼具倾斜24 h、昼夜颠倒、寝具垫料湿润、夹尾1 min。为确保刺激不可预见性, 每天的刺激方式随机抽签产生, 同一刺激不可连续应用。
1.2.3 旷场实验实验在上午8点到12点之间于安静、暗光的房间内进行。实验时, 将大鼠从尾部处轻轻提起, 放入旷场实验箱中间格内并开始计时。由两位实验人员协作观察并记录大鼠在3 min内的活动情况, 观察指标有:①穿越格数(以全部身体穿越格子边界为准); ②站立次数(以前肢全部离地为准)。每次观测结束冲洗大鼠大小便, 以免影响下次观测结果。随后更换动物, 重复实验。本实验采用单盲法。
1.2.4 强迫游泳实验(force swimming test, FST)将大鼠单独放置于40 cm×20 cm的玻璃缸内(水深20 cm, 水温25 ℃左右), 游泳全程时长6 min, 观察并记录后4 min内大鼠在水中累计不动的时间。每只大鼠实验结束后需清洗水缸、换水, 再继续对下一只大鼠进行测试, 以避免干扰。
1.2.5 糖水偏好实验(sucrose preference test, SPT)先进行糖水适应性练习, 待适应期训练结束后, 禁水24 h。24 h后开始试验, 每只鼠笼中放入两瓶100 mL的水, 分别为一瓶1%糖水和一瓶纯水, 2 h后开始记录, 分别记录糖水和纯水的消耗量。实验过程中, 需认真准确的读取每瓶水的量, 且水平放置位置需要保持一致, 并且可以保证大鼠可以正常饮用到水。糖水偏好度/%=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%
1.2.6 免疫组化取所有实验组大鼠脑组织, 并将标本在多聚甲醛液中室温固定24 h, 脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色后, 封片, 在光学显微镜下观察大鼠海马神经元的变化情况。
1.2.7 Western blot法检测提取大鼠海马处的总蛋白, 不同分子量蛋白来选择所配置的分离胶, 配置10%、12%或15%聚丙烯酰胺凝胶, 待胶凝固后按顺序加入待检测样本。后依次进行电泳, 转移, 封闭, 随后敷一抗4 ℃过夜。次日洗膜后敷相对应的二抗室温1.5 h, 洗膜, 最后用ECL发光剂进行检测, 曝光、显影, 以β-actin作为内参, 分别以目的蛋白与β-actin灰度值比值作为该目的蛋白的相对表达量。
1.3 统计学处理所有实验数据以x±s表示, 应用SPSS19.0软件进行统计学处理, 所有数据用t检验及方差分析处理。
2 结果 2.1 CHR对PDD模型大鼠自发活动和行为的影响旷场实验数据显示, 与空白组相比, 模型组大鼠单位时间内穿越格子数和站立次数全都有所减少, 差异具有统计学意义(P < 0.01);与模型组相比, CHR保护组大鼠单位时间内穿越格子数和站立次数都明显增加, 且随着CHR剂量的增加, 其增加幅度更加明显, 差异具有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01);如Fig 1A、B所示。在糖水偏好实验中, 与空白组相比, 模型组大鼠的糖水偏嗜度降低(P < 0.01);与模型组相比, CHR给药组大鼠的糖水偏嗜度增加(P < 0.05), 如Fig 1C所示。此外在强迫游泳实验中, 与空白组相比, 模型组大鼠FST不动时间延长(P < 0.01);与模型组相比, CHR(20、40、80 mg·kg-1)给药组FST不动时间显著减少(P < 0.05, P < 0.01)(如Fig 1D所示)。结果表明白杨素可以改善围绝经期抑郁模型大鼠的抑郁样行为。
2.2 CHR对PDD模型大鼠海马神经元的影响采用HE染色法观察大鼠海马神经元的变化。假手术组中, 海马神经元形态正常、排列整齐、饱满且界限清晰; 与空白组相比, 模型组中海马神经元数量减少, 细胞核核缩小甚至消失, 呈现外观不规则。给药后, 各组神经元不同程度改善, 数量增多且外观形态规则(见Fig 2)。结果表明, CHR对PDD大鼠海马神经元具有保护作用。
2.3 CHR对PDD大鼠海马NLRP3、ASC、caspase-1表达的影响采用Western blot法检测围绝经期抑郁模型大鼠海马中NLRP3、ASC、caspase-1的含量。结果如Fig 3所示, 与空白组相比, 模型组NLRP3、ASC、caspase-1的含量降低(P < 0.01);与模型组相比, CHR给药可以明显改善NLRP3、ASC、caspase-1的含量降低的情况, 此差异具统计学意义。结果表明, CHR能抑制NLRP3炎性小体相关蛋白表达, 其可能是CHR对海马神经元产生保护作用的机制。
2.4 CHR对PDD大鼠海马中IL-1β、IL-6和IL-18表达的影响采用Western blot法检测PDD模型大鼠海马组织中炎症因子的表达水平。结果Fig 4所示, 与空白组相比, 模型组IL-1β、IL-6、IL-18的表达增高(P < 0.01);与模型组相比, 给予CHR药物治疗后IL-1β、IL-6、IL-18的表达明显降低, 且差异有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01)。结果表明, CHR可以抑制炎症因子的表达, 进而有抗炎作用。
3 讨论PDD症是女性抑郁症患者中常见的类型之一, 易发病于更年期, 也就是在40~55岁[8]。本研究通过OVX和CUMS两步法建立大鼠模型, 以期模拟获得PDD症患者体内环境。通过旷场实验、糖水偏好实验、强迫游泳实验等, 以测试模型大鼠行为来确定是否患有抑郁症。本研究采用连续每天且不同应激方式来刺激大鼠, 其行为学结果表明, 大鼠患有抑郁样症状, 其具体有活动力降低、对新鲜环境表情淡漠等症状, 证实造模成功。
HE染色结果表明, 模型组大鼠的海马神经元数量减少、细胞核缩小, 而与假手术组相比较, 假手术组中大鼠海马神经元数量多、饱满且排列整齐, 细胞核也界限清晰, 二者有显著性差异, 具有统计学意义。在各CHR给药组中, 不同剂量给药, 对海马神经元的保护程度也不同, 中剂量和高剂量明显增加了神经元的数目, 与模型组相比, 差异具有统计学意义。
上述研究初步得出一个推断, CHR对PDD症模型大鼠的海马神经元具有保护作用; 然而, CHR对模型大鼠神经元具体通过什么途径和方式而产生保护作用的呢?研究报道[9]和前期预实验发现, 大鼠海马处的炎症因子水平升高, 比如IL-1β、IL-18和IL-6, 据此, 我们猜测大鼠可能是由于炎症发生而使得神经元发生凋亡; 而炎症产生的上游有可能是NLRP3炎性小体通路, 其也被证实存在于黑质致密部, 并参与炎症进程, 促使多巴胺能神经元发生凋亡[10]。NLRP3在中枢中表达广泛, 在海马中也有分布, 故而我们开展了进一步探讨其可能的作用机制的研究。NLRP3炎性小体是由NLRP3、ASC和pro-caspase-1组成, 一旦受外界刺激激活, 三者发生结合, pro-caspase-1剪切形成caspase-1, 将不成熟炎症因子(如pro-IL-6和pro-IL-18)剪切成活化状态(IL-6和IL-18), 进而启动炎症系统[11-12]。Western blot实验通过检测NLRP3炎性小体各蛋白表达水平发现, 复合物各蛋白水平表达升高, 炎症因子水平也升高, 明显高于假手术组。这个结果说明, NLRP3炎性小体参与了海马神经元的凋亡过程, 表明PDD症模型大鼠产生抑郁样行为与NLRP3炎性小体有关。
CHR是天然食源性黄酮类化合物, 研究报道具有抗氧化应激、抗炎等作用[13-14]。在该研究中, CHR可改善模型大鼠的抑郁样行为, 减少海马神经元的凋亡; 降低NLRP3炎性小体各蛋白表达水平和炎症因子的表达量。
综上所述, CHR对PDD症大鼠海马神经元具有保护作用, 其作用机制可能是通过调节NLRP3炎性小体信号通路, 进而发挥改善模型大鼠抑郁样行为的作用。这个发现为抑郁症相关中枢疾病提供了一定的理论基础, 为开发和利用天然产物在促进健康和疾病治疗方面提供了参考, 但其深层次的机制, 需要我们进一步去研究。
[1] |
黄宏丽, 沈捷雯, 董亚兰, 等. 针药并用对围绝经期抑郁症患者HAMD积分、SDS积分及HPO轴的影响[J]. 上海针灸杂志, 2017, 36(6): 705-6. Huang H L, Shen J W, Dong Y L, et al. Effect of acupuncture plus medication on HAMD, SDS and H-P-O Axis in perimenopausal depression patients[J]. Shanghai J Acup Moxib, 2017, 36(6): 705-6. |
[2] |
杨琴, 梁枫, 李正姐, 等. 鸡豆黄素A对围绝经期抑郁症大鼠的神经保护作用及机制研究[J]. 安徽医科大学学报, 2019, 54(1): 19-24. Yang Q, Liang F, Li Z J, et al. Research on effects and mechanism of Bioch A neuroprotection to rats in perimenopausal depression disorder[J]. Acta Univ Med Anhui, 2019, 54(1): 19-24. |
[3] |
Tan C C, Zhang J G, Tan M S, et al. NLRP3 inflammasome is activated in patients with medial temporal lobe epilepsy and contributes to neuronal pyroptosis in amygdala kindling-induced rat model[J]. J Neuroinflam, 2015, 12(1): 18. |
[4] |
李雪莲, 李智洋, 李宾公, 等. NLRP3炎症小体与糖尿病性心肌病研究进展[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(8): 1051-4. Li X L, Li Z Y, Li B G, et al. Research progress of NLRP3 inflammasome in diabetic cardiomyopathy[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(8): 1051-4. |
[5] |
Sahin Ozkartal C, Tuzun E, Kucukali C I, et al. Antidepressant-like effects of agmatine and NOS inhibitors in chronic unpredictable mild stress model of depression in rats: The involvement of NLRP inflammasomes[J]. Brain Res, 2019, 1725: 146438. |
[6] |
Darendelioglu E. Neuroprotective effects of chrysin on diclofenac-induced apoptosis in SH-SY5Y cells[J]. Neurochem Res, 2020. doi:10.1007/s11064-020-02982-8 |
[7] |
Li H, Chen A, Yuan Q, et al. NF-κB/Twist axis is involved in chysin inhibition of ovarian cancer stem cell features induced by co-treatment of TNF-α and TGF-β[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2019, 12(1): 101-12. |
[8] |
Gibbs Z, Lee S. Factors associated with depression during the perimenopausal transition[J]. Women's Health Issue, 2013, 23(5): e301-7. |
[9] |
Lopresti A L, Hood S D, Drummond P D. Multiple antidepressant potential modes of action of curcumin: a review of its anti-inflammatory, monoaminergic, antioxidant, immune-modulating and neuroprotective effects[J]. J Psychopharmacol, 2012, 26(12): 1512-24. |
[10] |
Kong H, Yang L, He C, et al. Chronic unpredictable mild stress accelerates lipopolysaccharide-induced microglia activation and damage of dopaminergic neurons in rats[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2019, 179: 142-9. |
[11] |
Yuze C, Huixue Z, Xiaoyu L, et al. Overexpression of MicroRNA-9a-5p Ameliorates NLRP3 inflammasome-mediated ischemic injury in rats following ischemic Stroke[J]. Neuroscience, 2020. doi:10.1016/j.neuroscience.2020.01.008 |
[12] |
刘杨, 段学清, 严福林, 等. 异绿原酸A抑制NLRP3炎性复合体/NF-κB活化减轻胶原诱导型关节炎大鼠炎症反应[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(10): 1415-9. Liu Y, Duan X Q, Yan F L, et al. Isochlorogenic acid A inhibits activation of NLRP3/NF-κB in rats with collagen-induced arthritis[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(10): 1415-9. |
[13] |
Abbas M M, Al-Rawi N, Abbas M A. Naringenin potentiated β-sitosterol healing effect on the scratch wound assay[J]. Res Pharma Sci, 2019, 14(6): 566-73. |
[14] |
Wojnar W, Zych M, Borymski S. Chrysin reduces oxidative stress but does not affect polyol pathway in the lenses of type 1 diabetic rats[J]. Antioxidants(Basel), 2020, 9(2): pii:E160. |