2. 南京大学金陵学院化学与生命科学学院, 江苏 南京 210089;
3. 江苏省中医院药学部 210029;
4. 南京中医药大学药学院, 江苏 南京 210023
2. Chemistry and Life Sciences Dept, Jinling College, Nanjing University, Nanjing 210089, China;
3. Pharmaceutical Dept, Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, China;
4. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
糖尿病是由多种病因引起的慢性代谢性疾病，据统计，2017年全球糖尿病患病人数为4.25亿，预计到2040年将达到6.12亿[1]。随着患病年龄的年轻化，糖尿病对男性生殖系统的影响逐渐引起人们的关注，长期的高血糖会造成成年男性生殖器官结构、生殖细胞发育成熟、生殖激素、性功能及子代健康的异常等，导致不孕不育[2-3]，因此加强糖尿病生殖损伤的研究具有重要的现实意义。
中医理论认为肾藏精、主生殖，糖尿病属于“消渴”的范畴，肾阴亏虚是糖尿病雄性生殖损伤的核心中医病机。生地-山茱萸药对是滋阴补肾法的代表药对体现，生地甘寒，清热凉血，养阴生津。山茱萸味酸涩微温，补益肝肾，涩精固脱，两药配伍加强补益肝肾之功能。本课题组前期研究发现，生地-山茱萸药对主要效应部位环烯醚萜苷可改善db/db自发性糖尿病小鼠肾脏功能，同时对睾丸病变也有着良好的保护作用，但具体机制还不明确。
糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是糖尿病环境下葡萄糖与体内蛋白质发生反应形成的老化产物。AGEs可直接[4]或与细胞膜上受体(receptors for advanced glycation end products，RAGE)结合，启动下游MAPK、NADPH、NF-κB等通路导致组织损伤[5-6]。梓醇是生地环烯醚萜苷部位的主要效应单体成分，能够通过阻断AGEs-RAGE的相互作用，抑制细胞内炎症反应改善糖尿病并发症[7]。马钱苷是山茱萸环烯醚萜苷部位的主要效应单体成分，通过下调AGEs-RAGE/鞘氨醇激酶(sphingosine kinase，SPHK)信号通路，改善糖尿病肾病[8]。故本研究拟基于AGEs-RAGE通路，通过自发性糖尿病小鼠生殖损伤动物模型、AGEs致生精细胞中精母细胞株(GC-2)损伤模型考察梓醇、马钱苷及其配伍对糖尿病睾丸病变的保护作用及机理。
1 材料与方法 1.1 实验试剂氨基胍(aminoguanidine，货号：079K1734V)，Sigma公司；马钱苷(货号：M-010-160516)，梓醇(货号：Z-005-160502)，HPLC≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司；AO/EB染色试剂盒(货号：KG501)，南京凯基生物技术公司；RAGE抗体(ab3611)，p65 NF-κB抗体(ab16502)，Bcl-2抗体(ab196495)购自美国Abcam公司；磷酸化p38MAPK抗体(4511s)，p38MAPK抗体(9212s)，磷酸化p65 NF-κB抗体(3039s)，Bax抗体(2772s)购自美国CST公司。
1.2 实验仪器酶标仪，美国Bio-Tek公司；二氧化碳细胞培养箱，日本三洋公司；倒置荧光显微镜，日本尼康公司。
1.3 实验方法 1.3.1 动物实验SPF级14~15周龄C57BL/6J小鼠、KK-Ay小鼠42只，♂，高脂饲料由北京华阜康生物科技公司提供，许可证号：SCXK(京)2014-0004。普通饲料购自于南京江宁青龙山动物繁殖场。动物实验遵循南京中医药大学伦理委员会的规定进行，动物伦理号：ACU-13(20161010)A。适应性喂养2周后，测量空腹血糖，将血糖值≥10 mmol/L的动物作为糖尿病小鼠，然后按血糖值随机分为模型组、阳性对照氨基胍组(100 mg·kg-1)、马钱苷低剂量组(50 mg·kg-1)、马钱苷高剂量组(100 mg·kg-1)、梓醇低剂量组(50 mg·kg-1)、梓醇高剂量组(100 mg·kg-1)以及配伍组(马钱苷50 mg·kg-1+梓醇50 mg·kg-1)，另取同期饲养的C57BL/6J小鼠作为空白组，每组5只小鼠。给药组小鼠以10ml·kg-1的给药容积灌胃相应药物，空白组和模型组小鼠则给予等量生理盐水，灌胃时长为8周。以上小鼠除空白组用普通饲料喂养外其余各组均以高脂饲料喂养，保持环境温度(20 ℃~25 ℃)，湿度55%，自由摄食饮水。
1.3.2 睾丸脏器系数的检测实验结束后，取小鼠睾丸，称重并计算脏器系数(睾丸/体重)。
1.3.3 HE染色实验结束后，取材并置于10%福尔马林溶液内，常规脱水、石蜡包埋、切片。进行HE染色，中性树胶封片。显微镜下观察，根据生精细胞排列、结构有无坏死病变、间质有无增生、有无炎性细胞增生判断病变轻重程度评分。
1.3.4 睾丸组织特异性标记酶、ATP、ROS、SOD的测定取睾丸组织，以生理盐水制成匀浆，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，按说明书测定睾丸匀浆中乳酸脱氢酶(LDH)(货号：A020-2)、酸性磷酸酶(ACP)(货号：A060-2)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)(货号：C017-2-1)、ATP(货号：A095-1-1)的活性。测定睾丸匀浆和GC-2细胞的SOD(货号：A001-1)和ROS(货号：E004)的含量。
1.3.5 细胞培养及分组10%FBS的RPMI 1640培养液，37 ℃，5%CO2常规培养GC-2细胞株，2 d换液1次，取对数增长期的细胞用于实验。将细胞分为空白组、模型组、马钱苷低剂量组(5 μmol·L-1)、马钱苷高剂量组(10 μmol·L-1)、梓醇低剂量组(5 μmol·L-1)、梓醇高剂量组(10 μmol·L-1)及配伍组(马钱苷5 μmol·L-1 +梓醇5 μmol·L-1)，其中模型组细胞用AGEs 200 g·L-1作用48 h，各给药组分别加入上述不同药物预处理1 h后再加入AGEs 200 g·L-1作用48 h，其中AGEs的制备过程参考文献[6]。
1.3.6 GC-2细胞凋亡的检测取对数生长期的GC-2细胞以每升5×107个密度接种于96孔板，当细胞融合至80%时，换无血清的培养液饥饿24 h。分组处理同“1.3.5”，终末将细胞用PBS漂洗两遍，取染液1(AO)与染液2(EB)以1 : 1混合，以1 : 25的比例用PBS稀释后滴加于培养孔中室温避光孵育10 min，置于荧光显微镜下观察。
1.3.7 Western blot给药及分组同“1.3.5”，PBS漂洗细胞两次，用RIPA裂解液抽提细胞总蛋白，睾丸组织用眼科剪剪碎后，加入RIPA裂解，离心收集上清蛋白，BCA法定量蛋白浓度。加入蛋白上样缓冲液预处理蛋白样品，电泳，转膜后用5%胎牛血清的封闭液封闭1 h，一抗4 ℃过夜。次日PBST洗膜，二抗室温孵育1 h后显影。利用Image J软件分析各组灰度值，以β-actin为内参，计算RAGE蛋白的变化。
1.3.8 统计学分析实验数据以x±s表示，并用SPSS22.0软件，采用One-way ANOVA单因素方差分析比较组间差异。
2 结果 2.1 梓醇(Cat)、马钱苷(Log)及其配伍对KK-Ay小鼠睾丸脏器系数和血糖的影响给药8周后，模型组小鼠的睾丸脏器系数明显低于空白组小鼠，空腹血糖明显高于空白组(P＜0.01)。而与模型组相比，氨基胍(Ami)、梓醇、马钱苷及其配伍可以不同程度地升高睾丸脏器系数，降低空腹血糖，差异具有统计学意义(P＜0.01)，见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of Log, Cat, alone or in combination on testicular viscera coefficient and fasting blood glucose level in KK-Ay diabetic mice (x±s, n=5) 1:Normal; 2:Model; 3:Ami 100 mg·kg-1; 4:Cat 50 mg·kg-1; 5:Cat 100 mg·kg-1; 6:Log 50 mg·kg-1; 7:Log 100 mg·kg-1; 8:Cat 50 mg·kg-1+Log 50 mg·kg-1.##P < 0.01 vs Normal, *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model |
空白组小鼠各个阶段生精细胞排列整齐紧密，形态结构完整，管腔中有成熟的精子细胞，模型组小鼠部分生精小管萎缩，细胞排列稀疏且结构紊乱，管腔中间成熟的精子细胞破坏较多，结构不完整，氨基胍、梓醇、马钱苷及其配伍给药组可以不同程度改善生精细胞的破坏，其中配伍组改善效果较优，管腔内侧见清晰的精子细胞结构，见Fig 2。
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| Fig 2 Testis pathohistology of KK-Ay diabetic mice improved by Log, Cat, alone or in combination (x±s, n=5) ##P < 0.01 vs Normal, **P < 0.01 vs Model, ▲P < 0.05 vs Cat 50 mg·kg-1+Log 50 mg·kg-1 |
模型组小鼠睾丸特异性标志酶(ACP、γ-GT、LDH)和ATP的活性与空白组相明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。氨基胍、梓醇、马钱苷及其配伍给药组可以不同程度地上调ACP、γ-GT、LDH和ATP的活性，见Fig 3。
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| Fig 3 Effects of Log, Cat, alone or in combination on testicular specific marker enzyme and ATP in KK-Ay diabetic mice (x±s, n=3) 1:Normal; 2:Model; 3:Ami 100 mg·kg-1; 4:Cat 50 mg·kg-1; 5:Cat 100 mg·kg-1; 6:Log 50 mg·kg-1; 7:Log 100 mg·kg-1; 8:Cat 50 mg·kg-1+Log 50 mg·kg-1. A: ACP and γ-GT levels in the testes; B: LDH levels in the testes; C: ATP levels in the testes ##P < 0.01 vs Normal, *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model |
AOEB实验结果显示：空白组细胞生长良好，细胞突起清晰可见，贴壁情况良好，呈亮绿色的荧光，AGEs 200 mg·L-1作用于GC-2细胞48h后细胞出现凋亡，发出橘黄色荧光，凋亡率上升(Fig 4A)，同时模型组小鼠睾丸和GC-2细胞bax的表达明显升高，bcl-2的表达明显降低，与空白组相比差异具有统计学意义(P＜0.01)，梓醇、马钱苷及其配伍可以明显改善糖尿病小鼠睾丸凋亡及AGEs诱导的精母细胞凋亡，配伍组改善效果较优(Fig 4B，4C)。
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| Fig 4 Anti-apoptotic effects of Log, Cat, alone or in combination on testis of diabetic mice and GC-2 cells induced by AGEs (x±s, n=3) A: GC-2 apoptosis detected by AOEB (×200); B: Western blot analyses of bax, bcl-2 protein expression in testis; C: Western blot analyses of bax, bcl-2 protein expression in GC-2 induced by AGEs. ##P < 0.01 vs Normal, **P < 0.01 vs Model, ▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01 vs Log 5μmol·L-1+Cat 5μmol·L-1 |
与空白组相比，模型组小鼠睾丸组织ROS水平明显升高，SOD活性明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)(Fig 5B、5C)，体外细胞实验结果显示：AGEs 200 mg·L-1作用于GC-2细胞48h后，活性氧ROS的水平明显升高，SOD活力明显降低(P＜0.01)，梓醇、马钱苷及其配伍能够不同程度地逆转，配伍组改善氧化应激效应最强，差异具有统计学意义(P＜0.01)，见Fig 5A、5D、5E。
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| Fig 5 Anti-oxidative stress effects of Log, Cat, alone or in combination on testis of diabetic mice and GC-2 cells induced by AGEs (x±s, n=3) A:ROS levels in GC-2 detected using DCFH-DA method; B: ROS levels in testis; C: SOD levels in testis; D: Statistic chart of ROS levels in GC-2 (D) SOD levels in GC-2 cells. ##P < 0.01 vs Normal, *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model, ▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01 vs Log 5 μmol·L-1+Cat 5 μmol·L-1 |
与空白组相比，模型组小鼠RAGE、Nox4表达上调，p38MAPK磷酸化增强，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而氨基胍、梓醇、马钱苷及其配伍可以逆转糖尿病环境下RAGE、Nox4的表达上调及p38MAPK磷酸化增强，其中配伍组逆转的效应最强(P＜0.05，P＜0.01)(Fig 6A, C)。体外结果显示：AGEs 200 mg·L-1作用于GC-2细胞48 h后RAGE蛋白被激活，与空白组GC-2细胞相比表达明显上调，同时p38MAPK磷酸化亦增强，Nox4表达上调，而给予梓醇、马钱苷及其配伍预处理组可明显抑制RAGE/p38MAPK、RAGE/ Nox4通路的激活(Fig 6B, D)。
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| Fig 6 Effects of Log, Cat, alone or in combination on AGEs-RAGE signaling pathway in testis of KK-Ay diabetic mice and GC-2 cells (x±s, n=3) A, C: Western blot analyses of RAGE protein expression, p38 MAPK phosphorylation and Nox4 protein expression in testis of KK-Ay dibetic mice; B, D:Western blot analyses of RAGE protein expression, p38 MAPK phosphorylation and Nox4 protein expression in GC-2 cells induced by AGEs. ##P < 0.01 vs Normal, *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model, ▲P < 0.05, ▲▲P < 0.01 vs Log 5 μmol·L-1+Cat 5 μmol·L-1 |
男性生殖损伤是糖尿病的并发症之一，随着糖尿病患病人数的急剧上升及患病年龄的年轻化，逐渐引起关注，但目前关于糖尿病男性生殖损伤的研究报道较少。西医治疗存在长期疗效不佳、药物副作用大。肾阴亏虚是糖尿病生殖损伤的核心中医病机。临床研究[9]报道了滋阴补肾治法对男性生殖障碍的防治，疗效确切。
生地-山茱萸药对是滋阴补肾法的代表药对体现，其中梓醇是中国药典规定的生地质量标准的代表效应单体成分，马钱苷是山茱萸中主要代表效应单体成分。因此本研究采用KK-Ay自发性糖尿病小鼠模型探讨梓醇、马钱苷及其配伍对睾丸病变的保护作用，这种自发性的动物模型接近人类发病的特点，是研究2型糖尿病的理想模型[10]。2015版药典记载山茱萸人临床用量为6~12 g，生地人临床用量为10~15 g，因在本研究中配伍组梓醇和马钱苷以等量合用，未涉及到复杂配伍。
体内动物实验结果表明，梓醇、马钱苷以及两者配伍组可以不同程度地改善糖尿病模型组小鼠的睾丸病理损伤，降低血糖，同时可以升高睾丸的脏器系数，提高睾丸特异性标志酶和ATP的活性，降低睾丸组织的氧化应激，改善睾丸细胞的凋亡。刘英姿等[11]先前报道了山茱萸总皂苷可明显降低糖尿病大鼠血糖、升高血清睾酮水平，提高睾丸、精囊腺的脏器系数，亦可提高糖尿病大鼠睾丸中标志性酶的活性，本研究与之前的报道是一致的，但药对代表效应成分的配伍改善糖尿病睾丸病变的效果要优于单用组，具体机制还未阐明。
AGEs在糖尿病及其并发症发生发展中起着重要的作用，本课题组认为，AGEs是糖尿病“肾阴亏虚、内热伤阴津”的重要物质基础，AGEs-RAGE通路在糖尿病雄性生殖损伤中亦扮演着重要的角色，AGEs、RAGE在男性糖尿病患者的睾丸、附睾、精子、生精上皮、精原细胞和精母细胞都有表达，明显高于非糖尿病患者，且精子DNA断裂与RAGE表达水平密切相关[12]。本研究中采用AGEs抑制剂氨基胍作为阳性对照组，发现氨基胍一定程度上亦可改善糖尿病环境下睾丸的损伤，这与orman之前的报道是一致的[13]。此外，Lv等[14]报道了生地、山茱萸等有效部位配伍可以通过干预AGEs-RAGE/Sphk改善db/db自发性糖尿病雄性小鼠肾脏的病理形态和功能，因此，我们推测梓醇、马钱苷及其配伍对糖尿病睾丸病变的保护作用与干预AGEs-RAGE通路相关。
精母细胞是精子成熟过程中一种重要的分化形态，本研究进一步以生精细胞中精母细胞株(GC-2)为模型进行AGEs损伤诱导造模，在该损伤模型的基础上探究梓醇、马钱苷及其配伍对生殖损伤的保护作用及其机制。实验结果显示，梓醇、马钱苷及其配伍对AGEs致GC-2损伤呈现明显的抗凋亡作用。文献报道生殖细胞的凋亡与氧化应激密切相关，在对糖尿病大鼠睾丸的研究中发现AGEs与受体RAGE诱导使细胞ROS的水平明显提高，氧化应激程度升高，SOD水平明显降低[15]。梓醇、马钱苷及其配伍对AGEs诱导GC-2细胞致氧化应激反应有不同程度的抑制及改善作用，且二者配伍改善氧化应激的效果较优。AGEs-RAGE其下游信号转导通路激活致大量促炎因子、促纤维因子的释放所介导的损伤是糖尿病并发症的核心病机，其中p38 MAPK、4型NADPH即Nox4是足细胞RAGE下游的两条核心通路，与凋亡和氧化应激密切相关[5-6]，本研究通过体内外模型检测了梓醇、马钱苷及其配伍对AGEs下游关键信号通路蛋白RAGE、p38 MAPK、Nox4的作用，实验结果表明，梓醇、马钱苷及其配伍可以不同程度逆转糖尿病环境下RAGE、Nox4的表达上调及p38MAPK磷酸化增强，其中配伍组逆转的效应最强，提示梓醇、马钱苷及其配伍对糖尿病生殖损伤的保护作用与干预AGEs-RAGE及其通路相关。
综上所述，本研究初步揭示了“滋阴补肾”药对生地-山茱萸代表效应成分通过调节AGEs-RAGE信号通路不同靶点改善糖尿病睾丸病变，配伍后增效，为临床上该药对基于“肾主生殖”治疗糖尿病生殖并发症提供理论依据。
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