硫化氢(H2S)是继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)后在体内发现的第3种气体信号分子[1-2]。内源性H2S与NO一样，也可由血管内皮产生和释放，可调节着血管张力和器官血流量。RhoA-ROCK信号通路参与了许多血管床中平滑肌细胞的收缩，在血管张力调节中发挥重要的作用，是心脑血管系统的新靶点[3]。在RhoA-ROCK信号通路中，RhoA系一种小分子鸟苷酸结合蛋白，是鉴定出的Rho家族的第一个成员。Rho相关的卷曲螺旋激酶(Rho-kinase, ROCK)为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员，是RhoA最重要的下游信号分子之一。RhoA被激活后可从细胞质中转位至细胞膜上，再激活其下游分子ROCK，从而参与包括细胞形状、运动、细胞收缩、增殖、血管平滑肌张力及炎症[4-5]等许多重要细胞功能的调节。ROCK有两种亚型，即ROCK1和ROCK2。我们以前研究表明，H2S可通过抑制RhoA-ROCK信号通路诱导脑血管舒张[6]。但尚不明确其抑制RhoA-ROCK信号通路的确切效应分子，即H2S是抑制RhoA，还是抑制ROCK及对其亚型有无选择性。因此，本课题利用RhoA抑制剂及siRNA干扰技术敲低ROCK表达，研究了H2S舒张大鼠脑血管作用与RhoA-ROCK信号通路中具体效应分子的关系进行了研究。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂ROCK1-siRNA(guide：UUGCUAGAAGCUUCAUAG)及其阴性siRNA、ROCK2-siRNA(guide：GCAGCAAUGGUAAGCGUAA)及其阴性siRNA均在广州锐博生物科技有限公司购买(批号：R0824)；EntransterTM in vivo-RNA，购买自北京英格恩生物科技有限公司(批号：No.18668111150825-1)；C3，购买自美国Apexbio公司(批号：B4897)，ROCK1(批号：ab45171)和ROCK2一抗(批号：125025)，购自英国abcam公司；乙酰胆碱(acetycholine, ACh)，购自Sigma公司(批号：BCBK5708V); NaHS，购自美国Sigma公司，实验前将其溶解在蒸馏水中并避光保存(批号：#SHBF1746V)；生理盐溶液(physiological saline solution, PSS)成分(mmol·L-1)：NaCl 118，KCl 4.7，CaCl2 1.6，KH2PO4 1.2，MgSO4 1.2，NaHCO3 25，EDTA 0.026，葡萄糖5.5，用NaOH将pH调节至7.4，并将95% O2和5% CO2的混合气体持续通入其中。
1.2 仪器DMT114P离体微血管压力直径测定系统(丹麦DMT公司)；FA1004型电子天平(上海天平仪器厂)；XTS-20连续变倍体式显微镜(北京泰克仪器有限公司)；凝胶电泳仪、电泳槽(美国BIO-RAD公司)；TGL-16H超速冷冻离心机(珠海黑马仪器有限公司)。
1.3 动物健康清洁级SD大鼠，雌雄各半，体质量(180~220) g。由安徽医科大学实验动物中心提供。实验动物合格证号：scxk(皖)2017-001。实验室内饲养温度为(22±3) ℃。所用实验动物的使用均符合安徽医科大学动物伦理委员会规定。
1.4 方法 1.4.1 血管舒张实验[7]将10%水合氯醛(3 mg·kg-1)腹腔注射入大鼠，麻醉后快速取出大脑并将其置于4 ℃的含95% O2和5% CO2混合气体预饱和的PSS液中。将大鼠脑基底动脉(cerebral basilar artery, CBA)在显微镜下小心地分离出后，将其周围的结缔组织去除后制成约3 mm的血管环，最后把血管环固定在含有5 mL的PSS液浴槽内，并用DMT114P离体微血管压力直径测定系统进行测定。在这期间，将95% O2和5% CO2的混合气体持续向槽内通入，并将浴槽内的温度维持在37 ℃。由测定系统的软件控制，在30 min内将血管环内压力从10 mmHg逐渐加压至60 mmHg后平衡1 h，并且期间每15 min更换一次槽内PSS液。然后，加入终浓度为60 mmol·L-1 KCl诱导血管环收缩(血管直径的减小)。当收缩达坪值时用PSS洗脱3次，平衡10 min后，再次用KCl诱导血管环收缩，添加ACh至终浓度10 nmol·L-1诱导血管舒张。若两次收缩坪值的差异小于10%时，则认为血管稳定性较好，若ACh诱导的舒张百分率达80%以上，则认为内皮完整，若如小于20%，则认为血管在功能上去除了内皮。最后，将血管环用PSS洗脱3次，并平衡10 min后，开始正式实验。
将内皮完整性较好的血管环随机分为对照组、C3孵育组和NaHS组。在内皮完整性较好的血管环中分别加入终浓度为1×10-5 mol·L-1 C3或等体积PSS孵育30 min后，用30 mmol·L-1 KCL诱导收缩，待血管环收缩稳定后，分别向液浴槽内加入累积终浓度为1×10-6、1×10-5.5、1×10-5、1×10-4.5、1×10-4、1×10-3.5和1×10-3 mol·L-1的NaHS来诱导血管舒张(血管直径的增大)，各浓度NaHS加药间隔时间为10 min(血管舒张稳定)。按下列公式计算血管舒张的百分率：
舒张百分率=(加NaHS后CBA直径-加KCl CBA后直径) /(加KCl CBA前直径-加KCl后CBA直径)×100%[8]
1.4.2 SiRNA在体转染[9]将SD大鼠随机分为正常对照(vehicle)组、EntransterTM in vivo-RNA转染试剂(transfection reagent)组、阴性siRNA(Neg-siRNA)组和ROCK1-siRNA组，每组6只，雌雄各半。将ROCK1-siRNA或Neg-siRNA用不含RNase的去离子水溶解制成终浓度为1 g·L-1溶液，然后分别在500 μL的ROCK1-siRNA溶液、Neg-siRNA溶液及EntransterTM in vivo-RNA溶液中加入500 μL的10%葡萄糖制成各相应的转染混合物。除正常对照组大鼠静脉注射1 000 μL的10%葡萄糖外，其他3组大鼠分别静脉注射1 000 μL的ROCK1-siRNA转染混合物、阴性siRNA转染混合物及EntransterTM in vivo-RNA转染混合物。转染48 h后，麻醉处死大鼠，按前述方法取出大鼠CBA，一部分CBA匀浆后-80 ℃中保存待Western blot法检测ROCK1蛋白的表达，另一部分CBA制成血管环进行血管舒张实验。
另取一批大鼠按同样方法制备ROCK2-siRNA转染大鼠，并测定脑血管中ROCK2蛋白表达和行脑血管舒张实验。
1.4.3 Western blot法[6]将保存的大鼠CBA匀浆在蛋白酶抑制剂存在下，加入1% SDS裂解缓冲液(25 mmol·L-1 Tris-HCl pH 7.6、150 mmol·L-1 NaCl、1% NP-40和1%脱氧胆酸钠)来裂解。脑血管裂解液中的蛋白含量用BCA进行测定。在10%聚丙烯酰胺凝胶中置入将含有20 μg蛋白质的裂解液后将其电泳分离，并将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将膜在室温下用含有5%脱脂奶粉和0.05%吐温20的Tris缓冲盐水封闭2 h后，在4 ℃下分别与抗ROCK1抗体、抗ROCK2抗体及抗β-actin抗体孵育过夜。然后在37 ℃下，加入二抗孵育1 h后，使用增强的化学发光试剂盒使条带可视化，通过测定条带光密度，以β-actin为内标来计算ROCK1、ROCK2蛋白表达的相对强度。
1.3 统计学处理采用graphpad6软件对实验数据进行分析，所有数据均以x±s来表示。两组之间比较采用t检验，两组浓度-效应曲线之间的显著性检验用单因素方差(One-way ANOVA)来分析。
2 结果 2.1 RhoA抑制剂C3预处理对H2S诱导的大鼠CBA舒张的影响如Fig 1所示，与溶媒对照比较，H2S供体NaHS在1×10-6~1×10-3 mol·L-1范围内明显地舒张大鼠CBA(P < 0.01)，并呈一定的浓度依赖性。这种舒张作用在添加血管收缩剂之前使用1×10-5 mol·L-1 C3转移酶预处理可明显地减弱NaHS诱导的大鼠CBA舒张(P < 0.01)，Emax从(112.8±1.8)%降低至(64.8±1.4)%。结果表明RhoA参与了H2S诱导的大鼠BA舒张作用。
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| Fig 1 Effect of RhoA inhibitor C3(1×10-5mol·L-1) on H2S-induced relaxation of rat cerebral basilar artery (x±s, n=6) **P < 0.01 vs vehicle; ##P < 0.01 vs NaHS |
大鼠在体转染48 h后，用Western blot法测定了CBA中的ROCK1蛋白表达。如Fig 2A所示，与对照组比较，阴性siRNA组和EntransterTM in vivo-RNA转染试剂组ROCK1表达均没有明显的改变，但ROCK1-siRNA组ROCK1蛋白表达有明显的降低(P < 0.05)，大约降低了60%左右。该结果表明大鼠在体转染ROCK1-siRNA可有效地减低脑血管中ROCK1蛋白的表达。
Fig 2B表明在体转染ROCK1-siRNA可明显地减弱NaHS诱导的大鼠CBA舒张(P < 0.05)，Emax从(112.8±1.8)%降低至(89.7±2.4)%，提示ROCK1也参与了H2S诱导的大鼠BA舒张作用。
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| Fig 2 Effect of transfection of ROCK1-siRNA in vivo on H2S-induced relaxation of rat cerebral basilar artery (x±s, n=6) A: Reduction in ROCK1 protein expression in the cerebral arteries from ROCK2-siRNA-transfected rats(Western blot method; B:NaHS-induced relaxations in the cerebral arteries from control rats and ROCK1-siRNA-transfected rats.**P < 0.01 vs control or vehicle; #P < 0.05 vs NaHS. |
与ROCK1-siRNA转染一样，大鼠在体转染ROCK2-siRNA可有效地减低脑血管中ROCK1蛋白的表达(P < 0.01)(Fig 3A)；Fig 3B表明在体转染ROCK2-siRNA也可明显地减弱NaHS诱导的大鼠CBA舒张(P < 0.01)，Emax从(112.8±1.8)%降低至(87.4±2.3)%，与在转染ROCK2-siRNA转染大鼠CBA上的Emax(89.7±2.4)%无明显的差异，提示ROCK2也参与了H2S诱导的大鼠BA舒张作用。
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| Fig 3 Effect of transfection of ROCK2-siRNA in vivo on H2S-induced relaxation of rat cerebral basilar artery A:Reduction in ROCK2 protein expression in the cerebral arteries from ROCK2-siRNA-transfected rats(x±s, n=3). B: NaHS-induced relaxations in the cerebral arteries from control rats and ROCK2-siRNA-transfected rats(x±s, n=6).**P < 0.01 vs control or vehicle; ##P < 0.01 vs NaHS. |
利用离体微血管压力直径测定法检测大鼠CBA的舒张作用，用RhoA抑制剂C3预处理后抑制RhoA活性，用siRNA转染技术在体敲低大鼠ROCK1和ROCK2表达。实验结果表明，H2S通过作用于RhoA、ROCK1和ROCK2导致RhoA-ROCK信号通路的抑制来发挥舒张大鼠脑血管作用。
3 讨论H2S对包括胸主动脉[10]、肠系膜[11]、肺[10]、肝动脉[11]及大鼠脑血管等多种血管床均有明显的舒张作用。有研究表明，H2S可通过开放ATP敏感性或钙激活钾通道，导致K+外流致平滑肌细胞发生超极化而产生血管舒张作用，但作为一种体内重要的气体信号分子，内源性H2S的血管舒张作用可能还有其他的机制。RhoA-ROCK传导通路是一种重要的细胞内信号转导机制，也参与多种血管收缩功能的调节。RhoA-ROCK传导通路的激活可使血管发生收缩，相反，该通路的抑制则可导致血管的舒张。有研究表明同样是气体信号分子的NO产生的血管舒张作用与RhoA-ROCK传导通路密切相关[11]。我们以前的研究表明，H2S也可通过抑制RhoA-ROCK传导通路来舒张大鼠脑血管[6]，但其作用的确切效应分子不明确。
本研究利用RhoA抑制剂C3预处理大鼠CBA，发现NaHS的脑血管舒张作用明显地减弱，表明RhoA与H2S舒张脑血管作用有关，这与我们报道的H2S可抑制大鼠脑血管中RhoA-ROCK传导通路[6]是一致的，提示RhoA是H2S舒张大鼠脑血管作用的RhoA-ROCK传导通路抑制机制中的效应分子之一。ROCK是RhoA最主要的下游效应分子，也直接关系着RhoA-ROCK传导通路的活性。本研究通过在体转染siRNA技术，有效地降低了大鼠脑血管中ROCK1和ROCK2的表达。无论在ROCK1-siRNA转染，还是在ROCK2-siRNA转染的大鼠CBA上，NaHS舒张脑血管作用均明显地减弱，表明H2S抑制RhoA-ROCK传导通路引起的舒张脑血管作用与ROCK也有关系。
硫巯基化(S-sulfhydration)是继磷酸化、乙酰化和S-亚硝基化等之后蛋白质翻译后的一种新的修饰方式。H2S可通过对靶蛋白上的半胱氨酸残基硫巯基化修饰[12]，使半胱氨酸的-SH基团转化为-SSH或过硫酸盐基团来影响靶蛋白的活性，如H2S硫巯基化KATP通道上的半胱氨酸残基可促进该通道开放[13-14]。ROCK羧基端有一个pleckstrin同源域，该域被一富含半胱氨酸残基的锌指状基序域(cysteine-rich zinc finger-like motif domain, CRD)分成两部分[15]，是否H2S也可硫巯基化CRD上的半胱氨酸残基来抑制ROCK的活性？这有待于我们今后的进一步研究。
综上所述，H2S通过作用于RhoA、ROCK1和ROCK2导致RhoA-ROCK信号通路的抑制来发挥舒张大鼠脑血管作用。
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