2. 西北工业大学医学研究院，陕西 西安 070012
2. Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, Xi'an 070012, China
子宫过度收缩与年轻女性的原发性月经痛和孕妇的早产密切相关。据统计，在年轻女性中需要使用药物来减轻原发性痛经疼痛的比率高达55%[1]; 孕妇早产的发生率在5%~15%之间[2]。子宫的收缩依靠肌层平滑肌的收缩。子宫平滑肌的收缩机制和分子通路与其它平滑肌相似——包括Ca2+的调控、肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用等。Ca2+作为细胞的第二信使，参与许多重要的生命活动，如细胞收缩、代谢、分泌和分化等。平滑肌细胞的Ca2+浓度的变化在子宫收缩过程中具有关键性的调控作用。其中细胞外Ca2+通过钙离子通道内流是平滑肌细胞升高胞内Ca2+浓度的重要途经，与子宫平滑肌层收缩密切相关[3]。
经典瞬时感受器电位通道6(transient receptor potential canonical 6, TRPC6)是一种对Ca2+具有通透性的非选择性阳离子通道。TRPC6通道可以被细胞内的第二信使二乙酰甘油(DAG)直接激活，而DAG来自于受体激活PLC水解PIP2而来，因此TRPC6属于受体门控通道(receptor-operated channel, ROC)[4]。研究证据表明，TRPC6通道蛋白在脑组织，含有平滑肌的组织、肾脏组织以及一些免疫细胞中均有分布，并参与相关的生理活动[5-8]。尽管在平滑肌细胞中，引起收缩的Ca2+内流主要是通过细胞膜去极化激活电压依赖性钙离子通道来实现的，但是近年来一些研究表明TRPC6通道在血管平滑肌收缩过程中发挥重要作用，包括小血管、主动脉血管和肺动脉血管等[9]。而在子宫平滑肌层TRPC6通道蛋白也有明显的分布，那么TRPC6通道在子宫收缩过程中扮演怎样角色？
本研究以小鼠离体子宫为研究对象，使用药理实验技术和基因敲除技术，研究TRPC6通道在小鼠离体子宫收缩过程中的作用; 并进一步分离小鼠子宫平滑肌细胞，在细胞水平验证TRPC6介导的Ca2+内流在子宫收缩过程中作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物本研究使用TRPC6-KO小鼠的种鼠购自Jackson Lab(Stock #37345-JAX)，实验使用的2~4个月小鼠，♀，体质量(20±2)g，在西北工业大学SPF级动物房由种鼠繁殖而来。由于TRPC6-KO小鼠的基因背景是C57BL/6和129S小鼠杂交，因此对照实验中的野生型小鼠(wildtype，WT)是野生型C57BL/6和129S小鼠杂交的第二代。C57BL/6和129S小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0006。使用异氟醚吸入麻醉小鼠后，断头处死。取出小鼠的子宫，清理子宫周围的结缔组织和脂肪。将子宫组织从子宫角的中部开始切割成3 mm长的子宫小环。小鼠子宫角的近端部分用于所有实验。按照参考文献所述，在取出子宫之前通过检查PBS冲洗阴道液中的细胞含量和形态来确定小鼠发情周期阶段[10]。
1.2 药物与溶液标准Krebs缓冲液(单位：mmol·L-1)：130 NaCl、5 KCl、2 CaCl2、1.2 NaH2PO4、0.56 MgCl2、25 NaHCO3和5葡萄糖。70 mmol·L-1 KCl溶液含有(单位：mmol·L-1)：65 NaCl、70 KCl、2 CaCl2、1.2 NaH2PO4、0.56 MgCl2、25 NaHCO3和5葡萄糖。
钙成像和膜片钳的细胞外液(单位：mmol·L-1)：145 NaCl，2.5 KCl，1.2 CaCl2、1 MgCl2、10 HEPES和5葡萄糖(用NaOH调节pH 7.2)。
OT，美国Sigma公司，批号：03251;His，美国Sigma公司，批号：59964。
1.3 等张张力检测将子宫小环安装在两个平行支撑金属丝上：一个起固定作用，另一个连接张力转换器(FSG-01张力传感器)。开始等张张力测试之前将子宫小环置于充满6 mL Krebs液体的恒温浴槽(37 ℃，TSZ-04离体组织灌流系统)中。通过调节金属丝的位置给予每个实验子宫小环约0.5 g的负荷[11]。在Krebs液中平衡30 min至1 h，待子宫收缩平稳，开始实验，使用Digidata 1440数字转化仪记录子宫小环的收缩。在记录收缩力的同时，将所有药物直接添加到组织浴中。本实验使用了离体的子宫小环而不是切开的子宫条去观察子宫的收缩，一定程度保持子宫的完整。另外我们之前的实验结果显示子宫条和子宫小环对催产素(oxytocin，OT)的反应没有明显的区别。
1.4 细胞培养子宫平滑肌的分离培养：将分离的子宫角纵向切开，在解剖显微镜下去除内膜层，将肌层剪碎。移置含有collagenase P (1 g·L-1)，0.2 mmol·L-1 CaCl2和0.125% BSA的消化液中，37 ℃消化40 min。吹打消化液至看不见明显的组织块，过滤移除没有消化的子宫组织。用PBS清洗消化下来的子宫平滑肌细胞，培养过夜后用于钙成像实验。
过表达TRPC6通道的HEK细胞：使用Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen)，将TRPC6和H1受体的cDNA质粒转染进入HEK细胞中，24 h后用于膜片钳记录TRPC6电流。
1.5 钙成像和膜片钳将培养过夜的子宫平滑肌细胞用PBS洗3遍后，加入4 μmol·L-1 Fura-2AM，室温放置1 h，使细胞充分负载钙离子荧光染料。随后使用PBS洗去溶液中的染料。使用Till-Photonics单细胞荧光成像系统检测细胞内钙离子浓度的变化。使用荧光信号比(F345/F380)的变化指示钙离子浓度的变化。使用细胞外高钾溶液(140 mmol·L-1 KCl)使细胞膜去极化，只有给予高钾溶液后引起胞内钙离子升高的细胞用于实验分析。
用Axopatch 200B放大器和Digidata 1550a数字化仪记录全细胞膜片钳模式下的TRPC6电流。pClamp 10软件包用于采集控制和数据分析。在60 mV的钳制电压下，以2 s的间隔给与-100~100 mV的电压刺激。TRPC6电流通过10 μmol·L-1的组胺(histamine，His)溶液激活。
1.6 PCR检测TRPC6-KO小鼠基因型取小鼠耳朵小片组织置于含有125 μL裂解液(NaOH=25 mmol·L-1，EDTA=0.2 mmol·L-1，pH12中90 ℃水浴中45 min，冷却后，加入等体积的中和液(Tris HCl=40 mmol·L-1)。离心后，上清用于PCR。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，TRPC6的引物信息：野生型WT-F 5′-TCT TTATGCAATCGCTGTGG-3′和WT-R 5′-GCTAGTCTTCCTGCAATCCA-3′。基因敲除型MUT-F 5′-TCTATTAACACTCAACTGGCACCT-3′和MUT-R 5′-GCCAGAGGCCACTTGTGTAG-3′。PCR产物用于鉴定小鼠的基因型:Trpc6-/- 175 bp和WT 378 bp。
1.7 数据分析子宫收缩张力使用平均收缩张力[12]，即为单位时间内曲线下面积，描述一段时间内子宫收缩的平均值。数据以x±s表示，并使用Sigma plot12进行分析。采用不配对t检验或秩和检验，确定两组数据是否存在差异。
2 结果 2.1 TRPC6通道抑制剂对OT宫缩作用的影响Fig 1A所示，小鼠子宫小环在Krebs液中稳定30~60 min后，收缩逐渐平稳，向浴液中加入OT后，引起子宫组织强烈的收缩，并且随着浓度的增加收缩逐渐增强。溶剂对照组(DMSO)中100 nmol·L-1 OT引起收缩强度倍数增加为(13.2±4.0，n=7), 而Pyr10组，增加的倍数为(5.0±2.1，n=8)，P < 0.05.说明TRPC通道抑制剂Pyr10(10 μmol·L-1)明显抑制OT引起的子宫收缩(Fig 1B)。
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| Fig 1 OT-induced uterine contractions inhibited by Pyr10 and Larixyl A: DMSO; B: Pyr10; C: Larixyl; D: Summary data. *P < 0.05 vs DMSO |
为进一步明确TRPC6在子宫收缩中的作用，在实验中使用特异性抑制TRPC6通道的Larixyl(10 μmol·L-1)[13]。Fig 1C的结果显示，Larixyl对OT的收缩作用也有明显的抑制作用(增加的倍数为5.6±2.5，n=5)。本实验研究结果表明，TRPC6通道抑制剂对离体小鼠子宫自发性的收缩没有明显的影响，但是明显抑制了OT引起的子宫收缩，并且抑制作用在高浓度OT(100 nmol·L-1)下更明显。
2.2 TRPC6-KO小鼠离体子宫的收缩因为研究中使用的TRPC6-KO小鼠是表达不具功能的TRPC6通道蛋白，因此使用商品的TRPC6通道蛋白抗体不能鉴别TRPC6-KO小鼠。因此使用Jackson Lab推荐protocol，用PCR来鉴定。PCR结果(Fig 2A)显示TRPC6-KO小鼠TRPC6基因为mutant型。如Fig 2B所示，OT引起TRPC6-KO (n=7)小鼠子宫的收缩张力的变化明显小于野生型(WT，n=5)小鼠。而在TRPC6-KO的小鼠子宫上，抑制剂larixyl(10 μmol·L-1)抑制OT(100 nmol·L-1)引起子宫收缩的作用明显减弱(Fig 2C)。结果进一步表明TRPC6通道参与OT引起的小鼠子宫的收缩。
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| Fig 2 Uterine contractions of TRPC6-KO mice A: PCR; B: Summary of OT-induced TRPC6-KO mouse uterine contractions; C: Effects of DMSO and Larixyl on OT-induced TRPC6-KO mouse uterine contractions. *P < 0.05 vs WT |
在浴液中加入OT后，离体子宫小环在开始出现强烈的收缩，而后收缩比较均匀平稳，但是随着时间的延长子宫小环的收缩会逐渐降低(Fig 3C)。但在TRPC6-KO小鼠子宫环上，OT引起收缩张力随时间延长，降低的速度要比WT缓慢(Fig 3A)。Fig 3B中对OT刺激后子宫每5 min平均收缩张力进行统计，连续统计4个时段。统计结果表明OT刺激后10 min后，WT子宫小环收缩明显减弱(n=5，第四个5 min与最初5 min平均收缩力的比值为0.23±0.06)，而TRPC6-KO子宫小环收缩减弱的幅度明显比较小(n=7，第四个5 min与最初5 min平均收缩力的比值为0.69±0.02)。TRPC6通道可以被GPCR-PLC通路生产的DAG直接激活，但是，如Fig 3D所示，过表达H1受体和TRPC6通道的HEK细胞上，His(10 μmol·L-1)诱发的TRPC6通道电流在达到最大值后，即使继续给予His刺激，电流幅度逐渐开始衰减[4]。因此OT缩宫作用衰减在TRPC6-KO子宫上有所缓解可能与TRPC6通道功能丧失有关。
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| Fig 3 OT-induced uterine contraction in WT and TRPC6-KO mice A: Represent uterine contraction traces from WT and TRPC6-KO mouse; B: Time-effect curves of WT and TRPC6-KO uterine contractions: the effect was presented by the ratio of each area under curve every five minutes and the first 5 minutes'; C: Histamine (His) induced TRPC6 current trace on HEK cells; D:Time trace of histamine induced TRPC6 current in HEK cells. The insert shows the sample current trace of current-voltage relationships acquired during the voltage ramps from-100mV to + 100 mV in HEK cells with TRPC6 overexpressing. **P < 0.01 vs WT |
在分离的小鼠子宫平滑肌细胞上，可以清楚看到100 nmol·L-1 OT引起细胞内钙离子浓度明显的升高，相应的，升高的细胞内钙离子浓度随着时间的延长开始下降(Fig 4A)。对WT和TRPC6-KO两组小鼠子宫平滑肌细胞的钙离子浓度在受到OT刺激后随时间衰减的时程曲线进行Exponential(standard)拟合。用tau值来表示衰减速度。如Fig 4B所示，TRPC6-KO组tau值(s)明显高于WT组(TRPC6-KO：68.7±12.3，n=10 vs WT: 38.8 ±11.8, n=8)。
OT可以引起小鼠离体子宫强烈的收缩，是体外模拟痛经子宫强烈收缩常用的工具药物。研究结果表明，痛经的年轻女性体内OT水平明显高于没有痛经的女性[14]。OT收缩子宫的作用主要是通过激活OT受体实现的。当OT受体被激活后由第二信使介导，通过平滑肌细胞膜上的钙离子通道介导的钙离子内流，和细胞内钙库释放钙离子升高细胞内游离钙离子浓度，从而引发宫缩。在这一过程中参与钙离子内流的钙离子通道主要包括电压依赖性钙离子通道和受体激活通道等。本研究所感兴趣的TRPC6通道是受体调控的，对钙离子据有通透性的通道之一。研究表明TRPC6在参与了血管平滑肌收缩的过程[9]。本文的结果表明，TRPC6通道的抑制剂对子宫自发性的收缩没有明显的影响，而比较明显抑制了OT引起的子宫的强烈的收缩。可能是TRPC6通道在OT受体被激活时才打开，进而介导钙离子内流，参与子宫的收缩。因此，TRPC6通道抑制剂的解痉作用可能会缓解子宫强烈收缩引起的痛经。
OT的作用比较迅速，给药后很短时间就引起子宫的强烈收缩，但是随时间的延长，缩宫作用逐渐衰减。然而，TRPC6通道功能丧失后，OT缩宫作用的衰减变得缓慢。TRPC6通道电流被受体激活后也存在衰减，这与通道和受体自身的磷酸化以及胞内钙离子浓度升高有关[4]。结合TRPC6通道激活电流的特征和本文实验结果推测，OT缩宫作用随时间的衰减可能与TRPC6通道电流的减小有关。但是值得注意的是，TRPC6功能丧失，OT缩宫作用的衰减减慢，但是依然存在。表明这是一个复杂的过程，可能有多种机制参与其中，包括OT受体的下调等，其它参与机制还有待进一步研究。
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