表1(Table 1)
2. 南昌大学第二附属医院病理科，江西 南昌 330006;
3. 南昌大学第二附属医院药剂科，江西 南昌 330006
2. Dept of Pathology,Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006 , China;
3. Dept of Pharmacy, Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006 , China
肝癌是消化系统常见恶性肿瘤，其发病与慢性肝炎病毒(乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒)密切相关。如何抑制肝癌组织中的炎症反应成为肝癌治疗的重要策略。脂氧素是人体内最重要的炎症自稳物质，在免疫自稳(包括炎症[1-2]及肿瘤[3-4])中扮演着重要角色，然而其半衰期极短且容易降解，不适合进行在体实验研究。而BML-111是其类似物，在结构上与脂氧素类似，而且两者的受体相同(均为甲酰肽受体2，FPR2)，保留了脂氧素功能所必需的基团，且不易降解，性质稳定，因而在实验研究中应用较广，研究发现其对炎症[5-6]及妊高症[7]具有明显的抑制作用。我们课题组研究发现，脂氧素及BML-111调控ILK轴抑制肝细胞癌EMT及转移[8]。而近年来研究发现，5-脂加氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)在多种癌组织中高表达并参与肿瘤的演进。本研究拟以人肝癌细胞细胞系(Hep3B)为实验对象，采用BML-111及Boc-2(FPR2阻断剂)干预Hep3B细胞，观察BML-111对Hep3B细胞迁移的作用及对5-LOX的调控作用，为抗肝癌研究提供实验依据。
1.1 试剂TRIzol(Invitrogen15596018);引物设计及合成(上海赛百盛); 逆转录相关试剂、PCR扩增仪(美国MJ research ABI9600);兔抗5-LOX(Santa Cruz Biotechnology，sc-20785);FITC荧光二抗(Boster，SA-1068);Boc-2(Sigma，06731);RPMI 1640(Gibco，31870074);BML-111(Cayman，10005032);血清(杭州四季青，2104)。
1.2 细胞培养与实验分组实验用Hep3B购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，置于培养箱培养。培养液中含20%胎牛血清(FCS)及双抗(青霉素和链霉素)。使用胰酶消化传代。采用第3~5代细胞进行实验。实验分为三组：(1)空白组; (2)BML-111组; (3)BML-111 +Boc-2组(Boc-2预处理30 min后，最后加入BML-111)。参考以往的文献，BML-111选择浓度为200 μg·L-1[9]。
1.3 免疫荧光实验24孔板接种细胞，给药，24 h后弃上清，用PBS洗板，冰甲醇固定，Triton破膜，BSA封闭，40 min后加入5-LOX一抗孵育4 h(4 ℃)后PBS洗，二抗(荧光)孵育l h(室温)，Hoechest染核，15 min后显微镜下观察，拍照。荧光强度为5-LOX的表达水平，分析采用ImageJ软件。
1.4 RT-PCR技术检测MMP-2和MMP-9表达TRIzol法提取RNA。逆转录具体过程如下：先测定RNA的浓度，将上样的总RNA量定为4 μg，根据浓度计算出需要上样的体积V，而后加入OligodT 1 μL，用DEPC补足，总体积定为16 μL。短暂离心后，接着70 ℃水浴约5min，迅速置于冰上至少1 min。接着加入其它成分(包括5×buffer 5 μL，dNTPmix 3 μL，M-MLV1 μL)，最后总体积为25 μL，离心后42 ℃水浴(60 min)，然后85 ℃水浴(7 min)，从而得到cDNA样本。PCR过程：反应体系总体积为25 μL，包括有12.5 μL PCR混合液，加入上、下游引物各1 μL，cDNA的上样量为1.5 μL，最后体积定为25 μL(用无菌水补足)。内参为GAPDH。反应条件及引物序列见Tab 1。经扩增、电泳、成像，最后半定量分析，每个样本均重复3次实验，以目的基因与内参之比作为其相对表达量。
| Target genes | Primers sequence pairs | Amplification protocols | ||||
| Initial melt | Melt | Anneal | Extend | Cycles | ||
| MMP-2 | 5′-CCAACTACAACTTCTTCCCTC-3′ 5′-TCCGTCCTTACCGTCAAA -3′ |
94 ℃,5min | 95 ℃,30 s | 57 ℃,45 s | 72 ℃,30 s | 35 |
| MMP-9 | 5′-GACTCGGTCTTTGAGGAGCG-3′ 5′-GAACTCACGCGCCAGTAGAA-3′ |
94 ℃,5 min | 95 ℃,30 s | 56 ℃,45 s | 72 ℃,30 s | 35 |
| GAPDH | 5′- ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG -3′ 5′- TTCAAGGGGTCTACATGGCAACTG -3′ |
94 ℃,5 min | 95 ℃,30 s | 56 ℃,45 s | 72 ℃,30 s | 35 |
(1) 细胞的准备：上室加入细胞悬液200 μL，加药。下室中，加入600~700 μL培养基，孵箱中培养，时间为24 h。(2)细胞计数：取出培养板，弃培养液，PBS洗2次。再加入冰甲醇固定细胞(10 min)，用棉签擦去上室中未迁移的细胞，然后用苏木素染色5 min，蒸馏水冲洗，在显微镜下拍照(随机选取视野)并计数。显微镜下计数细胞，统计学分析。
1.6 HE染色将细胞接种于六孔板中，加药作用24 h后，弃去上清，固定，染色。
1.7 统计学方法结果以x±s表示，采用SPSS18.0统计软件，进行单因素方差分析。
2 结果 2.1 BML-111对Hep3B细胞形态的影响Fig 1A所示，Hep3B细胞在未加任何刺激物的情况下，细胞呈多角形，多突起，细胞排列松散，体现了间质细胞的特点，即发生了上皮-间质转化(EMT)。而加入BML-111后，细胞排列紧密，突起明显减少，体现了上皮细胞的特点。而先加入受体阻断剂Boc-2后，BML-111并不能使其恢复上皮细胞形态，说明BML-111需要与受体结合发挥抑制EMT作用。
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| Fig 1 Effect of BML-111 on Hep3B cell morphology and migration (Bar=20 μm, x±s, n=3) *P < 0.0.05 vs Control group; #P < 0.0.05 vs BML-111 group |
Fig 1 B1及B2所示，在Transwell迁移实验中，3组穿膜细胞数分别为44.666 7±11.238 91、18.666 7±5.507 57和44.333 3±11.930 35。空白组Hep3B穿膜细胞的数目较多，而加入BML-111后，细胞数减少显著(P=0.019)，说明细胞迁移作用能被BML-111抑制。BML-111作用能被Boc-2阻断(P=0.020)。
2.3 BML-111对Hep3B 5-LOX表达及细胞定位的影响Fig 2A，B所示，在免疫荧光实验中，空白组Hep3B 5-LOX主要定位于细胞质和细胞核，加入BML-111后，5-LOX表达明显减少(P=0.000)，并且主要定位于细胞质。而用Boc-2预处理后，再加入BML-111，并不能抑制5-LOX的表达(P=0.000)。
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| Fig 2 Effect of BML-111 on Hep3B 5-LOX expression and cell location (Bar=20 μm, x±s, n=3) *P < 0.0.05 vs Control group; #P < 0.0.05 vs BML-111 group |
如Fig 3A1及A2所示，在Western blot实验中，空白组、BML-111组及BML-111+Boc-2组5-LOX的蛋白表达量(以与内参的灰度值比较)分别为1.563 7±0.116 29、0.443 3±0.110 60和1.616 7±0.137 96。在BML-111的作用下，5-LOX的蛋白表达量明显减少，与空白组比较，差异有显著性(P=0.000)。而用Boc-2预处理可阻断其作用，5-LOX并不减少(P=0.000)。如Fig 3B1，B2，B3所示，在RT-PCR实验中，空白组MMP-2、MMP-9的表达量分别为0.543 3±0.070 95和0.793 3±0.045 09，加入BML-111后，两者的表达量明显减少，分别为0.110 0±0.030 00和0.396 7±0.047 26，与空白组比，差异均有显著性(P值均为0.000)。而加入Boc-2预处理后，再加入BML-111，两者的表达量分别为0.556 7±0.109 70和0.813 3±0.075 06，与BML-111组比，差异均有显著性(P值均为0.000)。
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| Fig 3 MMP-2 and MMP-9 mRNA expression inhibited by BML-111 via down-regulating 5-LOX (±s, n=3) *P < 0.0.05 vs Control group; #P < 0.0.05 vs BML-111 group |
肝癌是国内常见的恶性上皮性肿瘤，其主要特征是生长迅速，早期发现困难，发现时往往为晚期，患者预后极差。如何抑制肿瘤转移是当前肿瘤研究的热点。肿瘤细胞由原发部位首先发生EMT转变，进而发生迁移、累及并侵犯周围组织，侵入脉管(包括血管和淋巴管)，转移至远隔脏器。而众所周知，肝癌与慢性肝炎、肝硬化(乙肝、丙肝所致)关系密切。持续的慢性炎症所致肝细胞的增生是肝癌发生的主要原因，因而，如何抑制肝癌组织内的慢性炎症是抑制肝癌的治疗靶点。
脂氧素由花生四烯酸合成，是体内最重要的免疫自稳物质，对炎症的消退及抗肿瘤方面都发挥着重要的功能，是体内调控免疫自稳的重要物质。我们课题组近年来研究发现，脂氧素及其类似物对肝损伤[5]及肝癌[8]均具有调控作用。但由于脂氧素的半衰期短，性质不稳定，不适合实验动物研究。而脂氧素类似物BML-111在结构上具有与脂氧素相同的功能基团，而性质又相对稳定，因此被广泛应用于实验研究。5-LOX是脂氧素合成过程中的最重要的酶类，并且参与了肿瘤演进过程。有研究证明，5-LOX在多种恶性肿瘤中高表达，并且调控了肿瘤演进的多个过程，研究5-LOX的抑制剂成为抗肿瘤研究的热点[10-14]。侵袭和迁移是恶性肿瘤的重要特征，与肿瘤的进展与预后密切相关。而我们的研究发现，BML-111能有效抑制肝癌细胞EMT和迁移，BML-111在蛋白水平能明显抑制5-LOX的表达，并且通过其受体发挥作用。MMP-2和MMP-9与肿瘤迁移密切相关，所以我们进一步在mRNA水平研究了BML-111是否能抑制MMP-2和MMP-9的表达，结果与我们预期的一致。
综上所述，BML-111的抗肝癌作用可能是调控多通路、多靶分子的功能。我们的研究为其抗肿瘤研究提供了新的思路，5-LOX可作为肿瘤治疗的靶点，BML-111抗肝癌机制非常复杂，尚需进一步深入并多方面研究。
( 本实验是在南昌乐悠生物有限公司实验平台完成，感谢何远桥老师及其团队所给予的支持和帮助 )
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