2. 江苏大学第四人民医院，神经疼痛、介入科，镇江 212001
2. Dept of Neurology, the Fourth Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212001, China
阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，AD)作为一种中枢神经系统退行性病变，常发生于老年前期或老年期，主要以进行性的记忆认知功能障碍、人格性格改变为特征，其主要病理特征为老年斑形成、神经原纤维缠结沉积、海马锥体细胞颗粒空泡变形以及神经元缺失等[1]。随着社会老龄化的发展，AD的发病率逐年升高，当前已经成为严重的社会问题。然而，迄今为止，AD的发病原因及其发病机制尚不明确。
越来越多的证据表明，转录调控异常与AD发生密切相关[2]。无论在AD细胞模型、转基因小鼠模型还是AD患者脑组织研究结果均证实mRNA转录水平的异常[3]。研究表明，FoxG1突变与许多神经发育障碍如Rett syndrome及小头症密切相关[4]。FoxG1作为叉头转录因子Fox家族中的一个成员，执行着转录抑制功能[5]。作为端脑特异性的转录抑制因子，在胚胎期主要调控小鼠端脑的形成。FoxG1不仅表达于胚胎时期的脑，也在整个成年期高度表达于哺乳动物的脑[6]，在脑发育早期，FoxG1主要选择性表达于端脑形成的增殖细胞群，FoxG1使细胞持续维持在增殖状态，并阻止其分化为神经元，参与神经可塑性的调控[7]；出生后FoxG1继续表达于海马齿状回和室管膜下区，调节出生后海马的神经形成[8]。FoxG1促进视网膜轴突的生长以及内耳[9]和嗅觉系统[10]的形成。然而转录调控因子FoxG1与AD的关系却鲜见报道。
本研究中的AD病变脑区FoxG1过表达小鼠拟通过Cre/loxp介导的基因重组方案构建(图 1)：loxp是一段长34 bp的DNA序列，是Cre重组酶识别的位点，被称为loxp位点。在兴趣基因FoxG1上游的一侧(通常称为"loxp-stop-loxp"或"LSL"盒)放置一个带loxp位点的终止密码子，可以抑制Cre缺失时的基因表达，在Cre存在的情况下，终止密码子被切除，基因表达继续进行。我们通过杂交CreERT2工具小鼠(B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)5-HT1B)和FoxG1条件性过表达小鼠(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)，获得CreERT2重组酶/FoxG1转基因子代小鼠[11]。CreERT2工具小鼠(B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)5-HT1B)的启动子为5-HT1Btm1，可以介导Cre重组酶在小鼠海马、皮层、纹状体脑区特异性表达；而ERT2是一个改造过的雌激素受体，可以被他莫昔芬活化，他莫昔芬的代谢产物4-OHT(雌激素类似物)与ERT2结合后诱导CreERT2入核发挥其重组酶活性[12]，进一步激活Cre重组酶识别loxp位点，基于以上方案，我们可以获得FoxG1条件性过表达小鼠。若在AD病模型小鼠基因背景的基础上构建FoxG1条件性过表达小鼠，可通过启动子5-HT1B诱导FoxG1过表达于AD的病变脑区(海马、皮层、纹状体)，也可基于AD特征性标记物(β-Amyloid)出现明显病理学改变的时间，进而选择他莫昔芬腹腔诱导的时间，通过cre/loxp介导的重组技术获得AD病变脑区FoxG1条件性过表达小鼠后，在该小鼠生长至6个月(β-Amyloid出现)后腹腔注射他莫昔芬诱导FoxG1过表达，获得最理性的构建方案。此外，当前的研究将就AD病变脑区FoxG1过表达小鼠鉴定、繁殖进行探讨，通过PCR，IHC及IF技术验证该模型小鼠的建立及FoxG1的蛋白表达，为FoxG1相关的AD的机制研究提供一个可信的动物模型。
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| Fig 1 Schematic diagram for conditional overexpression of FoxG1 mediated by cre/loxp strategy with genetic recombination |
实验所需的抗体如下：兔源GFP抗体(Bioss catalog # bs-0844R)。鼠源β-淀粉样蛋白抗体(Cell Signaling Technology, catalog # 15126)。山羊抗兔IgG二抗(碧云天，catalog # p0186-1)。山羊抗鼠IgG二抗(澳泉医疗科技有限公司，catalog # RQ7025)。
1.2 实验仪器光学显微镜(BX41，日本Olympus公司)，凝胶成像仪(GelDoc XP+, Bio-Rad公司)、电泳仪(DYY-6C型，北京市六一仪器厂)，水浴锅(HH-3A, 金坛市精达仪器制造有限公司)。
1.3 实验动物FoxG1条件性过表达(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)小鼠，品系B6/FVB，由东南大学赵春杰教授惠赠，雌雄各2只。B6; 129-5-HT1Btm1(CreERT)/Nju小鼠从南京模式动物研究中心引进[许可证编号：SCXK(苏)2018-0008]，♀♂各2只。APP/PS1双转基因小鼠B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju由南京模式动物研究中心引进，品系名称B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju，♂2只，♀6只。SPF级C57BL/6J小鼠购于江苏大学实验动物中心[许可证编号：SCxk(苏)2015-0001]。
1.4 小鼠的饲养小鼠的饲养按照SPF动物饲养标准执行，经隔离观察未见异常后进入饲养区，严格按照SPF动物管理相关规定进行实验操作。
1.5 小鼠鉴定采取剪去脚趾编号方法(剪取出生后5~6 d的子鼠的脚趾)，从后肢到前肢，从右到左依次编号。剪去的脚趾组织用于提取基因组DNA。基因组DNA提取大致步骤如下：(1)取小鼠脚趾(按1~10的顺序)放入1.5 mL EP管中，适当离心30 s使其沉于管底。(2)加入30 μL裂解液(0.5% 20% Tween-20, 1 mol·L-1 KCl 50 mmol·L-1, 1M MgCl215 mmol·L-1, 1 mol·L-1 Tris-HCl 2.5 mmol·L-1, pH 8.0，用前加200 mg·L-1蛋白酶K 3 μL), (3)55 ℃消化3~5 h, 12 000 r·min-1离心2 min, 95 ℃, 15 min，灭活蛋白酶K，12 000 r·min-1离心2 min，所获得的上清中DNA用于PCR模板，-20 ℃保存，用于基因型鉴定。
1.5.1 App/Ps1转基因小鼠的鉴定App/Ps1双转基因小鼠B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju基因型中，含有衰老基因序列ps1-dE9及App淀粉样前体蛋白基因序列APPswe融合体。采用两对引物1597/1598(App)和1644/1645(Ps1)进行小鼠基因型鉴定。引物1597和1598的序列分别为：5′-GACTGACCACTCGACCAGGTTCTG-3′和5′-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3′。引物1644和1645的序列分别为5′-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3′，5′-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3′。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60-65℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 5 min，35个循环；10 ℃保存。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后用Bio Rad凝胶电泳成像仪照相。
1.5.2 FoxG1条件性过表达(CAG-loxp-stop-loxp-FoxG1-IRES-EGFP)小鼠的鉴定引物GFP(up)和GFP(low)的序列分别为：5′- AAGGACGACGGCAACTACAAG-3′和5′-GGCGGTCACGAACTCCA-3′。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s, 72 ℃ 5 min；35个循环；4 ℃保存。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后用Bio Rad凝胶电泳成像仪照相。
1.5.3 B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)小鼠的鉴定两对引物5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2/Neo-3R的序列分别为：5′- AAGCTAAGTTCCTCGGGTATGGAAG-3A和5′-TCTGAGGCGGAAAGAACCAG-3′；5′-CTTCTTCATCATCTCCCTGGTGATG-3′，5′-CTGGTTCTTTCCGCCTCAGA-3′ PCR反应条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s, 72 ℃ 5 min；35个循环；10 ℃保存。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳。电泳完成后用Bio Rad凝胶电泳成像仪照相。
1.6 他莫昔芬给药方式玉米油(A0395699，ACROS)配制他莫昔芬(# T5648，Sigma)终浓度为20 g·L-1，37 ℃摇床过夜混匀，分装后-20 ℃避光保存。成年小鼠腹腔注射他莫昔芬(75 mg·kg-1)，隔天注射一次，连续2周。注射药物后的小鼠隔离饲养，注意观察。
1.7 组织准备小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，固定小鼠四肢，先用磷酸盐缓冲液(PBS)快速灌注左心室，然后取脑放置冰上，4 ℃预冷的4%多聚甲醛充分灌注，4%多聚甲醛后固定48 h。30%蔗糖脱水沉底。OCT包裹后速冻，冰冻切片机做大脑冠状切片，片厚20 μm。
1.8 免疫组化取小鼠脑组织于4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，制成6 μm厚冠状面切片。切片常规脱蜡至水，微波炉修复抗原，冷却后PBS洗涤，然后3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶10 min，β-Amyloid一抗(1：800)孵育4 ℃冰箱过夜，PBS洗涤后，山羊抗鼠IgG二抗(1 : 50)孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。经DAB显色，应用图像分析系统测量每个视野内阳性细胞数。
1.9 免疫荧光取小鼠脑组织于4%多聚甲醛中固定48 h后转移入30%的蔗糖溶液中，直至脑组织沉底，进行OCT包埋，-80 ℃冰箱速冻，冰冻切片机冠状面切片20 μm厚。PBS冲洗30 min后，微波炉抗原修复，降至室温后PBS洗3次，10%山羊血清封闭90 min，GFP一抗(1 : 50)过夜。Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG二抗(1 : 500)避光孵育2 h后，PBS清洗3次，每次3 min，甘油封片，镜检。
2 结果 2.1 阿尔茨海默病病变脑区FoxG1过表达小鼠的繁育方案FoxG1转基因小鼠与海马、皮层及纹状体特异脑区表达Cre重组酶的B6;129-5-HT1Btm1 (CreERT)工具小鼠交配，获得的子代再与AD模型鼠App/ps1转基因小鼠交配，得到在AD模型鼠病变脑区FoxG1条件性过表达小鼠。他莫昔芬注射诱导该小鼠(6月龄)海马、皮层及纹状体病变脑区过表达FoxG1蛋白。
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| Fig 2 Generation of mouse of FoxG1 overexpression in specific brain region based on App/Ps1mouse line |
PCR鉴定(引物为1597和1598(App)以及1644和1645(ps1)结果见图 3A，扩增出350bp和608bp两条条带的为App/ps1小鼠，如泳道5、6；扩增出350bp一条条带的为单纯App基因型的小鼠，如泳道1、2、3、4、7。
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| Fig 3 Genotype identification and comparison of β-amyloid protein expression for 2 and 6 months of App/ps1 mouse line A: Results of PCR; B: Expression of β-amyloid protein by immunohischemistry for 2 months. (B') Expression of β-amyloid protein by immunohischemistry for 6 months. |
免疫组化检测该模型小鼠皮层A-β淀粉样蛋白的表达，图 3B及3B'结果显示，随着周龄的增加，A-β淀粉样蛋白在小鼠前额皮层表达增加(B：2月龄AD模型小鼠，B'：6月龄AD模型小鼠)。
2.3 FoxG1条件性过表达小鼠的鉴定双重PCR鉴定FoxG1(引物为GFP(up)/GFP(low)以及鉴定Cre(5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2//Neo-3R)，鉴定结果表明，若PCR同时扩增出FoxG1基因的目的条带(378 bp)和Cre基因的目的条带(364 bp)的为FoxG1条件性过表达小鼠，仅扩增出一条420 bp条带为野生型小鼠，未扩增出FoxG1基因的目的条带(378 b)但扩增出Cre基因的目的条带364 bp的为Cre工具鼠。如图 4所示，编号3、4、6、7同时扩增出378bp的FoxG1目的条带和364bp的Cre基因目的条带，其中，编号3、4、7还扩增有420bp的Cre目的条带，可见，编号3、4、6、7的个体为FoxG1条件性过表达小鼠；编号2仅扩增出一条420 bp的目的条带，为野生型小鼠，编号5扩增出FoxG1基因的目的条带378 b和420 bp目的条带，为FoxG1转基因小鼠。
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| Fig 4 Identification of FoxG1 conditional overexpression mouse line |
三重PCR鉴定FoxG1：引物为GFP(up)/GFP(low)，鉴定Cre (5-HT1B-tR1/Neo-3F和5-HT1B-tF2/Neo-3R)以及鉴定App/ps1(1597/1598及1644/1645)，结果表明，泳道5、9、10、11、12、15为AD FoxG1条件性过表达小鼠Cre-foxg1;App-ps1。
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| Fig 5 Identification of App/ps1; Tg-FoxG1 mouse line |
6月龄AD FoxG1条件性过表达小鼠皮下注射他莫昔芬诱导Cre重组酶的表达，结果显示：与野生型小鼠相比，AD FoxG1条件性过表达小鼠前额皮层FoxG1表达显著增加。
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| Fig 6 Results of FoxG1 expression in the cortex in App/Ps1 mouse line Immunofluorescence with an antibody specific to EGFP was conducted on coronal brain section. Remarkable elevation of FoxG1-EGFP protein expression was found in cortex in B6;129-5-HT1Btm1 (CreERT); CAG-loxp-FoxG1-EGFP mice compared to WT mice. |
许多神经生物学疾病，如AD、抑郁症等都与海马神经元变性、缺失密切相关[13]。近年来，大量实验结果证明哺乳动物海马齿状回终生存在神经发生，新生的神经元成熟后参与整合到已经存在的神经环路中，可以补充和替代衰老的细胞而发挥生理功能，故此，促进海马神经发生能够改善动物的认知功能，这为AD的治疗带来希望[14]。
人类FOX(human forkhead-box)基因家族是一类具有W1环、W2环和3个α螺旋组成的FOX结构域的转录因子蛋白家族。FoxG1基因是FOX家族的重要成员之一，位于人染色体14q12其表达产物为FoxG1(又名脑因子-1, brain factor-1, BF-1)。大量研究表明FoxG1基因通过调控神经干细胞的增值和分化在胚胎脑发育的过程中起着关键性的作用，如果FoxG1基因表达缺陷将导致大脑皮层结构紊乱，出生后FoxG1仍持续表达于由端脑分化来的脑组织(大脑皮层、海马及基底核)中，而AD与这些病变脑区密切相关，实验室前期的研究结果表明AD的发生伴随着皮层、海马FoxG1蛋白表达的下调。2018年，东南大学赵春杰课题组发现FoxG1过表达于皮层边缘区可以诱导Cajal-Retzius细胞转化为海马齿状颗粒神经元。那么能否靶向调控皮层边缘区的FoxG1促进海马齿状颗粒神经元的形成，进而拮抗AD引起我们的极大兴趣，构建AD病变脑区FoxG1过表达小鼠将为AD的机制研究及靶向治疗提供必要的模型动物。
随着分子生物学技术的不断进展，转基因及基因敲除技术越来越成熟。条件性基因重组技术是将对某个基因的修饰限制于某些特定类型的细胞/组织或发育的某一特定时段，通常是在常规的基因重组基础上，利用重组酶Cre介导的位点特异性重组技术，在某些修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰处于一种时空可控状态[15]。
为了研究FoxG1基因对于AD的改善、调控作用，我们需要在AD小鼠病变脑区诱导FoxG1过表达。该问题解决的关键点是：①AD模型鼠的选择；②如何在AD病变脑区条件性诱导FoxG1过表达；③如何确保在AD出现典型的病理学改变-β Amyloid蛋白时验证FoxG1的保护、调控机制。为了解决以上问题，我们①选择了App/Ps1双转基因B6C3-Tg(APPswePSEN1dE9)/Nju小鼠，该转基因小鼠的基因型中，含有衰老基因序列ps1-dE9及App淀粉样前体蛋白基因序列APPswe融合体，能够保证AD典型病理学标记物β Amyloid蛋白的出现，而衰老基因序列ps1-dE9的转入又符合了AD作为一种老年病的机理有效性；②为了选择AD的病变脑区，我们应用了启动Cre重组酶的合理的启动子5-HT1B，5-HT1BmRNA主要存在于纹状体，海马(CA1区的锥体细胞层)，前扣带皮层(第4层)、基底神经节的伏隔核，下丘脑核，选择5-HT1B作为启动子，进而保证FoxG1条件性过表达于AD的病变脑区；③前期实验证明ADApp/Ps1双转基因小鼠6个月时β Amyloid蛋白才明显增加，为了探索AD出现典型的病理学改变-β Amyloid蛋白时FoxG1的保护机制，我们选择的Cre工具小鼠为B6;129-5-HT1Btm1(CreERT)，ERT2是一个改造过的雌激素受体，可以被他莫昔芬活化，他莫昔芬的代谢产物4-OHT(雌激素类似物)与ERT2结合后诱导CreERT2入核发挥其重组酶活性[12]，通过选择他莫昔芬的注射时间，我们可以保证在AD出现典型的病理学改变-β Amyloid蛋白时研究FoxG1对AD的的保护功能及其机制。
基于以上重组策略，我们可以获得AD病变脑区FoxG1条件性过表达小鼠，在该小鼠生长至6个月后腹腔注射他莫昔芬诱导FoxG1过表达，获得最理性的构建方案。此外，PCR，IHC及IF实验结果表明：与野生型小鼠相比，本研究构建的阿尔茨海默FoxG1过表达小鼠的大脑皮层FoxG1蛋白表达显著增加。
综上，应用合理的基因重组策略，成功制备了在AD病变脑区FoxG1过表达小鼠。为AD机制研究及靶向药物的研发提供一个可信的动物模型。
( 致谢: 本课题是在江苏大学医学院行为医学实验室完成，感谢课题组肖栩、薛程、李晓辉、周漾同学参与了本课题的行为学实验。)
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