红花注射液是红花经提取而成的灭菌水溶液，具有活血化瘀之功效，临床上主要用于闭塞性脑血管、冠心病和脉管炎等疾病的治疗[1]，其临床功效、作用特点和作用机制都较为明确。现代药理实验表明红花能够减轻缺血性损伤、改善心脑血氧供应、抗心肌缺血、抗凝血、抑制血小板聚集，并具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用[2]，从红花中分离得到的化学成分有醌式查尔酮苷类、黄酮类等多种活性成分。鉴于红花成分的多样性和药理作用多组分、多靶点的协同性, 现行质量标准采用的形态学鉴定、化学定性鉴别、指纹图谱及指标性成分检测，难以揭示其全部有效成分或特征成分，也难以表征理化成分与生物活性之间的相关性。生物活性的存在是实现药效作用的前提和基础，为使红花注射液质量标准能更好保证临床使用安全有效，在理化检测的基础上，增加特定中药生物活性的测定，以综合评价其产品质量[3]。研究采用胶原-肾上腺素诱导小鼠急性脑血栓模型，以红花注射液对小鼠的偏瘫保护率作为指标来考察红花注射液的抗血栓生物活性，为红花注射液生物活性限值测定方法的建立提供实验室依据。
1 材料 1.1 试剂胶原蛋白：COLLAGEN Bovine Achilles Tendon，Worthington公司，批号35E8048-C，规格1 mL：1 mg；盐酸肾上腺素注射液：天津金耀氨基酸有限公司，规格1 mL：1 mg，批号：0808282。
胶原蛋白-肾上腺素混合溶液配制：称取胶原蛋白15.00 mg，浸泡于10 mL生理盐水中4 h以上，研磨至溶液呈悬浮状态，3 000 r·min-1离心5 min，取上清液；另取1 g·L-1的肾上腺素0.5 mL，加入上清液中；加生理盐水至25 mL，制得0.6 g·L-1胶原蛋白-0.02 g·L-1肾上腺素溶液。
1.2 药品红花注射液：5个企业、5个批次。每支装10 mL，山西A企业，批号：H-1；每支装20 mL，湖北B企业，批号：H-2；每支装20 mL，四川C企业，批号：H-3；每支装20 mL，湖北D企业，批号：H-4；每支装5 mL，山西E企业，批号：H-5。
1.3 实验动物昆明种小鼠560只，清洁级，雄性，体质量(22±2)g，来源：解放军医科院实验动物中心，合格证号：SCXK(京)2007-004号；山西医科大学实验动物中心，合格证号：医动字第070102。BALB/C种小鼠20只，清洁级，雄性，体质量(22±2)g，来源：山西省肿瘤医院。实验动物使用许可证号：SCXY(晋)2009-0001，实验前动物适应试验室环境至少1周，自由取食、饮水，期间进行检疫，动物室维持12 h照明，温度(21±4)℃，相对湿度(50±20)%。
2 方法 2.1 抗小鼠体内血栓形成试验[4-8] 2.1.1 急性缺血模型制备将血栓诱导剂尾静脉注射至小鼠体内(0.1 mL·10 g-1)，造成小鼠血栓模型。
2.1.2 试验方法小鼠按体重随机分组，每组10只，分别为对照组、红花注射液组(10 mL·kg-1)，各组小鼠连续腹腔注射给药，对照组给予同体积0.9%氯化钠溶液，1次·d-1，于末次给药后尾静脉注射胶原蛋白混合诱导剂造模，注射后即观察5 min内小鼠死亡数及15 min内小鼠偏瘫未恢复数，结果以卡方测验(确切概率法)进行统计，并计算各组小鼠的偏瘫恢复率及供试品对抗小鼠体内血栓形成的保护率。
2.1.3 统计方法及结果判定实验结果采用SPSS软件进行统计分析，动物死亡与否为计数数据，采用卡方检验(准确概率法)进行统计。供试品组与对照组比较，15 min内小鼠偏瘫恢复数增加并具有统计学意义，且供试品组对抗小鼠体内血栓形成的保护率不低于50%，则判定实验结果阳性。
2.1.4 造模后小鼠恢复率、保护率的计算公式
|
按2.1试验方法，红花注射液批号为H-1批，取昆明种小鼠40只，随机分为4组，即红花注射液单次给药1 d组、多次给药3 d组、多次给药5 d组和对照组，红花注射液的给药剂量为10 mL·kg-1(5 g生药·kg-1)，分别于给药第1、3、5 d后尾静脉注入胶原0.6 g·L-1-肾上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，观察5 min内小鼠死亡数及15 min内小鼠偏瘫未恢复数。
2.2.2 胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂实验敏感剂量的选择按2.1试验方法，红花注射液批号为H-1批，取昆明种小鼠80只，红花注射液10 mL·kg-1(5 g生药·kg-1)连续给药3 d后尾静脉注入不同浓度胶原蛋白-肾上腺素混合溶液0.1 mL·10 g-1，观察5 min内小鼠死亡数及15 min内小鼠偏瘫未恢复数。
2.2.3 给药剂量及给药后造模时间的考察 2.2.3.1 正交试验选择最佳给药剂量和给药后造模时间按2.1试验方法，红花注射液批号为H-1批，取昆明种小鼠100只，连续给药3 d后尾静脉注入胶原0.6 g·L-1-肾上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，选用正交设计表L9(32)，以红花注射液不同给药剂量及给药后造模时间为影响因素，以供试品抗小鼠体内血栓形成的保护率为考察指标进行试验，因素水平设计表见Tab 3。
2.2.3.2 正交试验结果验证由正交试验结果分别选择最差实验控制条件A1B3(1.67 g·kg-1剂量；给药后60 min造模)和最好实验控制条件A3B2(5 g·kg-1剂量；给药后45 min造模)，取红花注射液H-1批连续给药3 d，末次给药45 min后尾静脉注入胶原0.6 g·L-1-肾上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，按2.1试验方法进行重复。
2.2.4 不同品系小鼠的考察按2.1试验方法，红花注射液批号为H-1批，取昆明种、BALB/C小鼠各20只，红花注射液5 g生药·kg-1剂量给药3 d，末次给药后45 min尾静脉注入胶原0.6 g·L-1-肾上腺素0.02 g·L-1混合溶液0.1 mL·10 g-1，即刻观察5 min内小鼠死亡数及15 min内小鼠偏瘫未恢复数，比较不同品系小鼠对试验结果的影响。
2.2.5 试验系的确定依照试验系考察结果，确定试验最佳条件。
2.3 方法学验证[9-11] 2.3.1 重复性考察取红花注射液H-1批，按2.1试验方法和2.2.5确定的试验条件重复6次试验。
2.3.2 中间精密度考察取红花注射液H-1批，分别改变实验室内部条件(不同人员、不同工作日和试验时间)，按2.1试验方法和2.2.5确定的试验条件进行试验。
2.3.3 重现性考察取红花注射液H-1批，按2.1试验方法和2.2.5确定的试验条件分别在不同实验室进行试验。
2.4 不同批号红花注射液抗血栓活性的考察取5批红花注射液，按2.1试验方法和2.2.5确定的试验条件进行试验。
3 结果 3.1 试验系的考察 3.1.1 给药周期的选择Tab 1结果显示，造模后对照组小鼠10只死亡，死亡率100%，各红花注射液给药组小鼠死亡数减少、15 min偏瘫恢复数增加，单次给药1 d组恢复1只小鼠、保护率为10%, 多次给药3 d组和多次给药5 d组分别恢复6只、7只小鼠、保护率分别为60%、70%，与对照组比较差异有显著性(P < 0.01)。
| Group | Dose | Administration cycle | n | Recovery number | Recovery rate/% | Protection rate/% |
| Control | / | / | 10 | 0 | 0 | |
| Honghua | 5 g·kg-1 | 1 d | 10 | 1 | 10 | 10 |
| injection | 3 d | 10 | 6** | 60 | 60 | |
| 5 d | 10 | 7** | 70 | 70 | ||
| **P < 0.01 vs control | ||||||
Tab 2结果显示，随混合诱导剂剂量降低，对照组小鼠死亡数减少、15 min偏瘫恢复数增加，红花注射液各诱导剂组小鼠恢复数基本一致。与同诱导剂剂量对照组相比，红花注射液胶原0.60 g·L-1-肾上腺素0.02 g·L-1诱导组、胶原0.54 g·L-1-肾上腺素0.018 g·L-1诱导组和胶原0.48 mg·L-1-肾上腺素0.016 g·L-1诱导组小鼠的偏瘫恢复数有显著性差异(P < 0.05或0.01)；胶原0.42 g·L-1-肾上腺素0.014 g·L-1诱导组小鼠恢复数与其他组基本一致，与同诱导剂剂量对照组比较没有差异，保护率为33%。
| Dose of inducer | Group | Recovery number | Recovery rate/% | Protection rate/% |
| Collagen 0.60 g·L-1- | Control | 0 | 0 | |
| Adrenalin 0.02 g·L-1 | Honghua injection | 6** | 60 | 60 |
| Collagen 0.54 g·L-1- | Control | 0 | 0 | |
| Adrenalin 0.018 g·L-1 | Honghua injection | 6** | 60 | 60 |
| Collagen 0.48 g·L-1- | Control | 2 | 20 | |
| Adrenalin 0.016 g·L-1 | Honghua injection | 7* | 70 | 62 |
| Collagen 0.42 g·L-1- | Control | 4 | 40 | |
| Adrenalin 0.014 g·L-1 | Honghua injection | 6 | 60 | 33 |
| **P < 0.01 vs control；*P < 0.05 vs control | ||||
Tab 4、5结果显示，给药剂量和给药后造模时间对抗小鼠体内血栓形成的保护率均有明显影响(P < 0.05)，影响的主次顺序为给药剂量＞给药后造模时间。经方差分析，给药剂量三水平之间差异明显，给药后造模时间三水平之间差异明显。直接观察9组数据，最好试验条件为8号(A3B2)、其保护率为78%，最差试验条件分别为1号(A1B1)、3号(A1B3)和6号(A2B3)，保护率为11%。经计算分析最佳试验条件为A3B2，即小鼠以5 g·kg-1剂量腹腔注射给药，并于给药后45 min尾静脉注射胶原-肾上腺素诱导造模；最差试验条件为A1B3，即小鼠以1.67 g·kg-1剂量腹腔注射给药，并于给药后60 min尾静脉注射胶原-肾上腺素诱导造模。直接观察与计算结果一致。
| Level/Factor | A(Dose) | B(Time) |
| 1 | 1.67 g crude drug·kg-1 (10 times the clinical human dose) |
30 min |
| 2 | 3.4 g crude drug·kg-1 (20 times the clinical human dose) |
45 min |
| 3 | 5 g crude drug·kg-1 (30 times the clinical human dose) |
60 min |
| No | A(Dose) | B(Time) | Recovery number | Protection rate/% | P |
| 1 | 1(1.67 g·kg-1) | 1(30 min) | 2 | 11 | 0.531 2 |
| 2 | 1(1.67 g·kg-1) | 2(45 min) | 4 | 33 | 0.121 3 |
| 3 | 1(1.67 g·kg-1) | 3(60 min) | 2 | 11 | 0.531 2 |
| 4 | 2(3.4 g·kg-1) | 1(30 min) | 4 | 33 | 0.121 3 |
| 5 | 2(3.4 g·kg-1) | 2(45 min) | 6* | 56 | 0.019 0 |
| 6 | 2(3.4 g·kg-1) | 3(60 min) | 2 | 11 | 0.531 2 |
| 7 | 3(5 g·kg-1) | 1(30 min) | 5* | 44 | 0.050 0 |
| 8 | 3(5 g·kg-1) | 2(45 min) | 8** | 78 | 0.001 6 |
| 9 | 3(5 g·kg-1) | 3(60 min) | 6* | 56 | 0.019 0 |
| T1 | 55 | 88 | |||
| T2 | 100 | 167 | |||
| T3 | 178 | 78 | |||
| T1 | 18.333 3 | 29.333 3 | |||
| T2 | 33.333 3 | 55.666 7 | |||
| T3 | 59.333 3 | 26.000 0 | |||
| R | 41.000 0 | 29.666 7 | |||
| **P < 0.01 vs control；*P < 0.05 vs control | |||||
| Source of variance | Degree of freedom | SS | MS | F | P |
| A(Dose) | 2 | 2 582.0 | 1 291.0 | 14.95 | 0.014 |
| B(Time) | 2 | 1 584.7 | 792.3 | 9.18 | 0.032 |
| Error | 4 | 345.3 | 86.3 | ||
| Sum | 8 | 4 512.0 |
Tab 6验证结果与正交试验结果相符，在A1B3试验条件下小鼠偏瘫恢复3只，与对照组相比没有显著差异，保护率为13%；在A3B2(5 g·kg-1剂量；给药后45 min造模)试验条件下小鼠偏瘫恢复7只，与对照组相比有显著差异性(P < 0.05)，保护率为63%。
| Group | Dose | Time | n | Recovery number | P | Protection rate/% |
| Control | / | / | 10 | 2 | ||
| A3B2 | 5 g·kg-1 | 45 min | 10 | 7* | 0.024 6 | 63 |
| A1B3 | 1.67 g·kg-1 | 60 min | 10 | 3 | 0.605 6 | 13 |
| *P < 0.05 vs control | ||||||
红花注射液对远交群(昆明种)和近交系(BALB/C)小鼠体内血栓形成有明显的保护作用(P < 0.05)，小鼠偏瘫恢复数与对照组比较差异有显著性(P < 0.05)，保护率分别为55%和62%。
3.1.5 确定试验系取健康合格，体质量(20~24) g，同一来源的昆明种雄性小鼠，按体重随机分为2组，每组不少于10只。每日于大致相同的时间分别给每鼠腹腔注射0.1 mL·10 g-1(5.0 g生药·kg-1)红花注射液或等体积0.9%氯化钠溶液，每日1次，连续注入3次，于末次注入45 min后尾静脉注射胶原0.60 g·L-1-肾上腺素0.02 g·L-1造成小鼠急性脑血栓模型，即刻观察5 min内小鼠死亡数及15 min内小鼠偏瘫未恢复数，采用卡方检验(准确概率法)进行统计，计算各组小鼠的偏瘫恢复率及供试品对小鼠体内血栓的保护率。对照组动物偏瘫恢复率控制在不大于20%条件下，供试品组与对照组比较，小鼠偏瘫恢复数增加并具有统计学意义，且供试品组体内血栓形成的保护率不低于50%，则判定实验结果阳性。以红花注射液5.0 g生药·kg-1剂量作为生物活性试验的检测限值。
3.2 方法学验证 3.2.1 重复性考察Tab 8结果显示，6次试验对照组动物偏瘫恢复率均不大于20%，供试品组与对照组相比小鼠偏瘫恢复数差异有显著性(P < 0.05或0.01)，保护率均不低于50%，以保护率计算RSD值，为10.0%，重复性较好。
| Strain | Group | n | Recovery number | Recovery rate/% | Protection rate/% |
| Kunming | Control | 10 | 1 | 10 | |
| Honghua injection | 10 | 6* | 60 | 55 | |
| BALB/C | Control | 10 | 2 | 20 | |
| Honghua injection | 10 | 7* | 70 | 62 | |
| *P < 0.05 vs control | |||||
| No | Dose | Recovery number | Positive rate(P) | Protection rate/% | RSD/% |
| 1 | 6* | 0.019 0 | 56 | 10.0 | |
| 2 | 7* | 0.024 6 | 62 | ||
| 3 | 5 g·kg-1 | 6** | 0.003 4 | 60 | |
| 4 | 7** | 0.006 2 | 67 | ||
| 5 | 6* | 0.019 0 | 56 | ||
| 6 | 5** | 0.009 8 | 50 | ||
| **P < 0.01 vs control；*P < 0.05 vs control | |||||
Tab 9结果显示，A、B、C三位实验人员、分别在第1、8、15工作日的不同工作时间进行试验，各对照组动物偏瘫恢复率均不大于20%，各供试品组与对照组相比小鼠偏瘫恢复数差异有显著性(P < 0.05或0.01)，保护率均不低于50%，中间精密度较好。
| Operator | Time | Dose | Recovery number | Positive rate(P) | Protection rate/% |
| A | D 1(9：00~11：30) | 5 g·kg-1 | 6* | 0.019 0 | 56 |
| B | D 8(14：00~16：30) | 7** | 0.006 2 | 67 | |
| C | D 15(12：30~15：00) | 6** | 0.003 4 | 60 | |
| *P < 0.05 vs control, **P < 0.01 vs control | |||||
Tab 10结果显示，在不同实验室分别进行试验，各对照组动物偏瘫恢复率均不大于20%，各供试品组与对照组相比小鼠偏瘫恢复数差异有显著性(P < 0.05或0.01)，保护率均不低于50%，重现性较好。
| Laboratory | Dose | Recovery number | Positive rate(P) | Protection rate/% |
| Shanxi Institute for Food and Drug Control | 5 g·kg-1 | 7** | 0.006 2 | 67 |
| Modern Research Center of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University | 7* | 0.024 6 | 62 | |
| *P < 0.05 vs control, **P < 0.01 vs control | ||||
| Group | Dose | n | Recovery number | Recovery rate/% | Protection rate/% |
| Control | / | 24 | 3 | 12 | |
| H-1 | 5 g·kg-1 | 19 | 9* | 47 | 52 |
| H-2 | 5 g·kg-1 | 18 | 12** | 67 | 71 |
| H-3 | 5 g·kg-1 | 21 | 5 | 24 | 24 |
| H-4 | 5 g·kg-1 | 20 | 12** | 60 | 62 |
| H-5 | 5 g·kg-1 | 20 | 7 | 35 | 38 |
| *P < 0.05 vs control, **P < 0.01 vs control | |||||
5批红花注射液中，H-1、H-2、H-4批样品小鼠15 min偏瘫恢复数明显增加，与对照组比较差异有显著性(P < 0.05或0.01)，保护率为52%、71%、62%，表明H-1、H-2、H-4批样品对胶原－肾上腺素诱导的体内血栓小鼠有显著的保护作用，H-3、H-5批样品也可增加小鼠偏瘫恢复数，但与对照组比较差异没有显著性，保护率为24%和38%。
4 讨论胶原蛋白和肾上腺素均为血小板聚集诱导剂，合用有显著的协同作用，二者小剂量混合，静脉注射可诱发小鼠血栓性偏瘫和死亡[4]；红花注射液具有活血化瘀的功效，可抑制血小板聚集，拮抗由该模型诱导的小鼠血栓性偏瘫和死亡。该模型动物廉价易得、诱导剂使用剂量小、操作简单易行，整体试验条件和环境易于控制、具有较好的重复性, 符合中药生物活性测定的基本原则。在前期的药物筛选试验中，红花注射液对胶原-肾上腺素诱导的小鼠体内血栓模型比较敏感，能够表达出不同企业之间和同一企业不同批号之间的活性差异。因此进一步探讨作为红花注射液生物活性的评价指标。
诱导剂剂量是试验系的影响因素之一：诱导剂剂量过大，小鼠死亡数多、偏瘫难以恢复，无法体现药物的保护作用；诱导剂剂量过小，则小鼠偏瘫模型不明显，难以判断是药物的保护作用还是动物机体的自身抵抗，无法计算药物对小鼠偏瘫的保护率。试验过程发现不同来源和批次的同品系小鼠对胶原-肾上腺素混合诱导剂的敏感性也有差异。为使诱导剂能引起大多数正常小鼠血栓性偏瘫，且引起的血栓性偏瘫程度在药物的保护范围，应使对照组动物偏瘫恢复率控制在不大于20%的范围内。试验确定的胶原-肾上腺素混合诱导剂参考剂量范围在胶原0.6 g·L-1-肾上腺素0.02 g·L-1~胶原0.54 g·L-1-肾上腺素0.018 g·L-1之间，以胶原0.6 g·L-1-肾上腺素0.02 g·L-1为宜。
红花注射液对胶原-肾上腺素诱导的昆明种小鼠和BALB/C小鼠体内血栓模型均有保护作用，其中昆明种小鼠为远交群，相对于近交系BALB/C小鼠出笼量大、抗病力强、环境适应力强，在试验过程中能经受多次给药等操作刺激，且价格便宜，因此选择昆明种小鼠为实验动物。连续给药3 d和5 d后红花注射液对急性脑血栓小鼠均有显著保护作用，考虑到经济、快捷，选择3 d为试验给药周期。
选用两因素三水平正交设计表L9(32)，给药剂量为主要因素，给药后造模时间为次要因素，二者三水平之间差异显著。相同给药后造模时间对急性血栓小鼠的保护作用与剂量呈正相关。有研究报道红花中色素类成分在抑制血小板聚集的同时对已聚集的血小板有非常明显的解聚作用，且随剂量的增加而逐渐增强[12]。
考察5家不同企业的5批红花注射液生物活性，对胶原-肾上腺素诱导的小鼠体内血栓保护率分别为52%、71%、24%、62%、38%，其中H-1、H-2、H-4批样品对胶原－肾上腺素诱导的小鼠偏瘫恢复有显著性差异(P < 0.05或0.01)，显示5个不同企业的红花注射液生物质量有差异，胶原-肾上腺素诱导的小鼠体内血栓模型可对这种差异进行区分。红花注射液各企业间生产工艺存在不同，药效物质羟基红花黄色素A对热不稳定, 各企业半成品、成品的灭菌温度与时间差别较大, 可能是造成样品生物活性差别的原因之一。应进一步积累数据，为红花注射液生物活性限值测定方法的建立提供实验室依据，作为红花注射液现行质量标准的有益补充，以期对红花注射液的质量属性进行综合评价。并经系统对中药生物活性限值测定法的开发、建立和应用，为中药制剂质量生物评价提供研究方法和思路。
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