焦虑/抑郁症是当今严重危害人类身心健康的两种常见精神疾病，给家庭和社会造成沉重负担[1]。焦虑/抑郁常同时发生，目前常用的焦虑/抑郁症动物模型主要有应激诱导型焦虑/抑郁模型和药物诱导型焦虑/抑郁模型等[2-3]。但这些造模方式普遍存在着操作复杂、可重复性差等不足，使得焦虑/抑郁症的基础研究备受限制。因此，发掘一种遗传性的焦虑/抑郁动物模型无疑具有重要的意义。
Fawn-Hooded(FH/Wjd)大鼠是由Wistar大鼠近亲繁殖到第19代得到的近交系大鼠，具有饮酒量大、酒精偏爱度高、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)异常、行为绝望明显等特征，其抑郁特性已得到明确，是研究抑郁症的理想的动物模型[4-6]。然而，FH/Wjd大鼠的焦虑特性及其相关生化改变的深入研究目前尚不明确。因此，本研究基于既往研究基础，以Sprague-Dawley(SD)大鼠为对照[4-8]，观察FH/Wjd大鼠的焦虑特性及其机制，为FH/Wjd大鼠在神经精神领域的应用提供部分实验数据。
1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂Topscan旷场、高架十字迷宫行为学系统(Cleversys Inc.美国)；CoulochemⅢ高效液相库伦阵列电化学仪(ESA美国)；Excellence Plus天平XP型(梅特勒-托利多瑞士)；Multistan Go多波长酶标仪(Thermo美国)；NANO DROP 2000超微量分光光度计(Thermo美国)；实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad美国)。大鼠儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)、单胺氧化酶(monoamine，MAO)、皮质酮(corticosterone，CORT)、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ATCH)ELISA试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司，批号分别为JL13490、JL12455、JL11379。3，4-二羟基苯乙酸(3, 4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、多巴胺(dopamine，DA)、高相草酸(homovanillicacid，HVA)、5-HT、5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)标准品均购自美国Sigma公司，批号分别为153-98-0、BCBP2642V。TRIzol、逆转录试剂盒均购自大连宝生物公司，SYBR PCR Mix(Bio-Rad美国)。
1.2 实验动物3月龄♂SPF级SD大鼠，体质量(300~350) g，购自陆军军医大学大坪医院实验动物中心[许可证号为：SCXK(渝)2017-0005]。3月龄♂ FH/Wjd大鼠，体质量(280~300) g，由北京大学药物依赖研究所梁建辉教授馈赠，并引进繁殖，饲养于遵义医科大学基础药理教育部重点实验室SPF级实验动物房(许可证号：SYXK黔2014-003)，12 h光照/黑夜循环，室温(21~25) ℃，湿度50%~60%。
1.3 行为学检测 1.3.1 高架十字迷宫实验高架十字迷宫(elevated plus maze，EPM)是由一对高开臂和一对闭合臂组成。利用大鼠对新异环境的好奇、探究特性与高空畏惧回避所形成的矛盾冲突来评价其焦虑状态。将大鼠从中央区域面朝开放臂放入，仪器记录10 min内大鼠在各臂的活动情况。
1.3.2 旷场实验旷场箱是由4个长、宽、高均为40 cm的方形盒子组成，箱子底部被划分为中央区域和外周区域。旷场实验(open field test，OFT)利用大鼠的趋避性与面对开阔环境的探索驱动所形成的矛盾冲突，来评价其紧张度和焦虑行为。将大鼠从固定的一角放入，使其自主活动10 min，记录大鼠在外周及中央区域的活动情况。
1.4 DA、5-HT及其代谢产物检测 1.4.1 色谱条件QUATTRO 3 C18反相氨基酸色谱柱，150×2.1 mm(Chrom4，USA)，内径5 μm。流动相为pH3.2的缓冲液[含50 mmol·L-1柠檬酸钠，90 mmol·L-1磷酸氢二钠，1.7 mmol·L-1辛烷磺酸钠，0.5 μmol·L-1乙二胺四乙酸钠]-乙腈(92:8，V/V)。0.22 μm滤膜抽滤，超声脱气15 min，HPLC仪使用前流动相平衡过夜。电化学检测器工作电极为石墨碳，检测参数ChannelⅠ-150 mV，ChannelⅡ 300 mV，guard cell 350 mV。柱温30 ℃，流速0.21 mL·min-1，进样量20 μL。
1.4.2 样本制备称取皮层组织约80 mg，按1 mg组织对应加入12.5 μL 5%的HClO4溶液，冰上匀浆，后转移置1.5 mL离心管中4 ℃ 14 000×g离心10 min去蛋白，取上清按1 : 2的体积加入流动相稀释，混匀后用0.22 μm针头滤器过滤样本，进样。
1.5 ELISA实验称取皮层组织，按1 : 9的重量体积比例，加入PBS，冰上充分研磨，将匀浆液于4 ℃ 5 000×g离心10 min，分装上清液，冻存于-80 ℃，待测。按ELISA试剂盒说明书进行操作。
1.6 实时荧光定量RT-PCR [9]取(50~100) mg组织置于1 mL TRIzol中冰上匀浆，提取组织中的总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，荧光定量PCR检测各基因的表达。PCR引物由上海生工生物有限公司合成，GAPDH上游序列5′-CCAAGGAGTAAGACCCCTGG-3′，下游序列5′-AGGGGAGATTCAGTGGTG-3′，COMT上游序列5′-CCAGCAGCTCACACCACATC-3′，下游序列5′-ATGCCTCTGCCTCCTG GATA-3′。
1.7 mRNA-seq检测取SD、FH/Wjd大鼠海马样本，送至上海天昊生物科技有限公司进行mRNA-seq测序。
1.8 统计学分析所有数据以均数±标准差(x±s)表示，使用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，两组间比较采用独立样本t检验。
2 结果 2.1 FH/Wjd大鼠与SD大鼠焦虑行为比较Fig 1A所示，与SD大鼠比较，FH/Wjd大鼠在EPM闭合臂的活动距离及活动总路程均显著高于SD大鼠(P < 0.05；P < 0.05)；Fig 1B所示，FH/Wjd大鼠在OFT中央区域活动的距离低于SD大鼠，活动总路程显著高于SD大鼠(P < 0.05)。
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| Fig 1 Difference in anxiety behaviors between FH/Wjd rats and SD rats (x±s, n=9~10) The results of elevated plus maze test (A) and open field test (B).*P < 0.05 vs SD group. |
Fig 2A所示，与SD大鼠比较，FH/Wjd大鼠皮层DA、DOPAC含量较低，差异无统计学意义，HVA含量无明显差异；Fig 2B所示，FH/Wjd大鼠DOPAC/DA无明显差异，HVA/DA显著较高(P < 0.05)；Fig 2C所示，FH/Wjd大鼠皮层组织中COMT活性显著较高(P < 0.01)。
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| Fig 2 Difference in metabolism of DA between FH/Wjd rats and SD rats (x±s, n= 9~10) The contents of DA, DOPAC and HVA in rats cortex tissues detected by HPLC-ECD(A); The metabolism ratio of DA (B); The enzyme activity of COMT in rats cortex tissue detected by ELISA(C).*P < 0.05 vs SD group, **P < 0.01 vs SD group. |
Fig 3A所示，与SD大鼠比较，FH/Wjd大鼠皮层组织中5-HT(P < 0.01)含量显著较低，5-HIAA含量无差异；Fig 3B所示，FH/Wjd大鼠5-HT代谢率显著较高(P < 0.01)；皮层组织MAO活性显著较高(P < 0.01，Fig 3C)。
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| Fig 3 Difference of 5-HT metabolism between FH/Wjd rats and SD rats (x±s, n=9~10) The contents of 5-HT and 5-HIAA in rats cortex tissues detected by HPLC-ECD (A), the metabolism ratio of 5-HT(B), the enzyme activity of MAO in rats cortex tissue detected by ELISA(C). **P < 0.01 vs SD group. |
Fig 4所示，FH/Wjd大鼠皮层CORT、ACTH含量均显著高于SD大鼠(P < 0.01；P < 0.01)。
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| Fig 4 Contents of CORT and ACTH in cortex tissues between FH/Wjd rats and SD rats detected by ELISA assay (x±s, n=9~10) **P < 0.01 vs SD group. |
Fig 5所示，FH/Wjd大鼠皮层、海马、纹状体及血清中COMT mRNA的相对表达量均高于SD大鼠(P < 0.01)。
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| Fig 5 Expression of COMT mRNA in different tissues between FH/Wjd rats and SD rats detected by real-time PCR (x±s, n=9~10). **P < 0.01 vs SD group. |
在两个主成分(PC1、PC2)的情况下，得分图中能够观察到SD大鼠与FH/Wjd大鼠的基因在不同纬度上各自聚类，SD大鼠与FH/Wjd大鼠显著区别。
2.6.2 FH/Wjd大鼠与SD大鼠差异基因富集通路KEGG通路富集显示SD大鼠与FH/Wjd大鼠差异基因在神经活性配体受体途径富集程度最高，见Fig 7。
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| Fig 6 PCA of transgenic contours of rat hippocampus gene at genome level (n=3) |
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| Fig 7 KEGG analysis of differentially expressed genes between FH/Wjd rats and SD rats (n=3) |
SD大鼠与FH/Wjd大鼠富集在神经活性受体配体途径的主要差异基因有18个：Cnr2、Nmur2、Avpr1a、Fshb、P2ry2、Ntsr1、Calcr、Gabre、Npffr2、Lpar3、Mlnr、Rxfp3、Chrna5、Tacr3、Sstr1、Ptgdr、C5ar1、P2rx1，其功能涉及突触传递、神经元投射、神经递质传递等方面(Fig 8)。
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| Fig 8 Heat map analysis of rat neuroactive ligand-receptor interaction pathway genes (n=3) Red represents up-regulation, green represents down-regulation. |
既往研究表明，与SD大鼠比较，FH/Wjd大鼠在强迫游泳实验中不动时间明显较长，糖水偏爱率较低；水迷宫实验中逃避潜伏期较长，转棒实验中在棒停留时间较短，具有明显的行为绝望、快感缺失、学习记忆低、疲劳耐力差等显著抑郁特性[4, 7]。EPM、OFT是利用探索与回避形成的矛盾冲突来评价焦虑行为的经典方法[10]。本实验结果表明，FH/Wjd大鼠在EPM和OFT中自发活动性较高，EPM臂闭活动距离较多，OFT中央区域活动距离较少，因此，与SD大鼠比较，FH/Wjd大鼠同时也具有明显的焦虑行为及高活动性。
焦虑/抑郁的发生与单胺类神经递质功能紊乱密切相关，DA和5-HT是重要的单胺类神经递质[11-12]。DA主要在COMT的作用下被代谢为DOPAC和HVA，5-HT在MAO作用下生成5-HIAA。本研究结果显示，FH/Wjd大鼠DA、5-HT含量低于SD大鼠，其变化与FH/Wjd大鼠的抑郁行为相符；同时，FH/Wjd大鼠COMT、MAO活性、5-HIAA/5-HT、HVA/DA比值均显著高于SD大鼠，提示FH/Wjd大鼠DA、5-HT代谢亢进，其机制与FH/Wjd大鼠的高活动性及焦虑行为相一致。因此，FH/Wjd大鼠中枢DA、5-HT含量低下、但代谢亢进等异常表现可能与其抑郁、焦虑共病有关。
下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)轴功能紊乱是焦虑/抑郁症发生的重要机制，CORT、ACTH含量能够一定程度反映HPA轴的功能状态[13]。本研究结果显示FH/Wjd大鼠CORT、ACTH含量均显著高于SD大鼠，提示FH/Wjd大鼠存在HPA轴亢进，与其焦虑/抑郁的行为学表现一致。
COMT具有代谢儿茶酚胺类神经递质、儿茶酚胺类雌激素和外源性化合物的作用，COMT基因突变引起COMT表达或活性改变，进而与帕金森症、阿尔茨海默症、精神分裂症及注意缺陷障碍、重度抑郁症等疾病的产生密切相关[14]。目前，COMT被视为多种精神疾病的候选基因或诊断标志物[15]。研究报道在注意力缺陷多动症模型、精神分裂症患者中COMT含量或mRNA的表达均显著高于正常组[16]。本研究结果表明，FH/Wjd大鼠中枢、外周COMT相对表达量均较SD大鼠高，提示FH/Wjd大鼠可能存在神经精神系统的异常。同时，本实验还采用了mRNA-seq技术对SD大鼠、FH/Wjd大鼠海马组织中所有的基因进行了检测，结果表明，SD大鼠与FH/Wjd大鼠基因表达存在明显差异，其差异基因主要富集在神经活性受体配体途径，进一步提示了FH/Wjd大鼠在神经精神系统的基因表达存在差异。
综上所述，本研究通过FH/Wjd大鼠与SD大鼠比较，发现FH/Wjd大鼠具有明显的焦虑行为和高活动性，其机制可能与DA、5-HT含量低下、代谢亢进，HPA轴亢进，COMT异常，神经精神系统的异常有关。
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