2. 江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室,江西 南昌 330004
2. Key Lab of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China
2型糖尿病是一种以高血糖、胰岛素抵抗为主要特点的疾病,改善机体胰岛素抵抗是治疗2型糖尿病的主要途径之一[1]。维吾尔族药“古丽娜”,即石榴花(pomegranate flower)是石榴科落叶灌木或小乔木石榴Punicagranatum L.的干燥花瓣,有良好的抗2型糖尿病及并发症、保护循环系统、抗炎、抗氧化、保肝等作用[2-3],但其抗2型糖尿病的活性成分与作用机制尚不明确。以高脂饮食和链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠及胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,探讨石榴花不同萃取部位对胰岛素抵抗的影响及作用机制,为石榴花在2型糖尿病中的应用提供实验依据。
1 材料 1.1 药物与试剂石榴花药材购自新疆和田,经新疆医科大学兰卫教授鉴定为石榴科石榴属植物石榴Punicagranatum L.的干燥花瓣;链脲佐菌素(streptozocin, STZ, Lot WXBC2544V)购自美国Sigma公司;葡萄糖测定试剂盒(Lot 20190508231)购自上海荣盛生物药业有限公司;糖化血清蛋白(GSP, Lot 20180828)、总胆固醇(TC, Lot 20180825)、甘油三酯(TG, Lot 20180825)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C, Lot 20180825)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C, Lot 20180825)、还原型谷胱甘肽(GSH, Lot 20180824)、丙二醛(MDA, Lot 20180828)测定试剂盒、血清胰岛素(FINS)测定试剂盒(Lot R20180829)均购自南京建成生物工程研究所;CCK-8试剂盒, Lot 091918181104)购自上海碧云天公司;胎牛血清(FBS, Lot 072419190816, 上海碧云天公司分装)、DMEM高糖培养基(Lot 8119058)购自美国Gibco公司;PPARγ(Lot 8FIE5DBC, Akt(Lot 00071929, Akt-phospho-s473(Lot 10011010, PI3K(Lot 10005702, Glut4(Lot 0057210)antibody购自ProteinTech公司;β-actin(Lot N20610、N10610、N10528)、显影液(Lot M20926)购自北京全式金公司。
1.2 实验动物SPF级SD雄性大鼠60只,体质量(200±20)g,购自江西中医药大学动物实验科技中心,合格证号为SCXK(赣)2018-0003。动物饲养于江西中医药大学动物实验科技中心SPF级环境中,12 h/12 h日夜循环条件,自由采食,室温(22±2) ℃,相对湿度为45%~55%,适应性喂养1周后开始实验。
1.3 细胞株3T3-L1前脂肪细胞,由中国科学院细胞库提供。
1.4 仪器酶标仪(美国Thermo公司)、电泳仪(北京六一实验仪器有限公司)、显影仪(德国AnalytikJena公司)。
1.5 给药溶液的提取与制备取8 kg干燥的石榴花药材用高效多功能粉碎机粉碎,60%乙醇加热回流提取2次,每次60 min,提取液合并后过滤,(50~60) ℃加热减压浓缩制得石榴花总提物浸膏,留取部分浸膏,剩下浸膏加入适量双蒸水混悬,分别用二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取至有机溶剂呈无色,萃取后剩余为水部位,回收溶剂得各部位浸膏[4],所得浸膏进行冷冻干燥,提取率为58.93%,分别得乙酸乙酯、正丁醇、水部位浸膏163.33、867.70、3 617.55 g,于-20 ℃保存,临用现配,精密称定后用双蒸水稀释至所需浓度。
2 方法 2.1 动物实验 2.1.1 2型糖尿病模型的建立高脂饲料(猪油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、预混料2.1%、麦芽糊精2.2%、普通繁殖鼠料54.6%)喂养大鼠6周,禁食12 h后腹腔注射35 mg·kg-1 STZ(溶于pH 4.5的0.1 mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,注射前配制,避光使用),正常组同期腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液。造模7 d后禁食12 h,尾静脉采血测定空腹血糖,空腹血糖(FPG)>11.1 mmol·L-1则为造模成功,若造模不成功则补注35 mg·kg-1 1% STZ 1次。
2.1.2 分组与给药将造模成功的SD大鼠分为模型对照组、阳性对照组及各部位给药组,未造模大鼠为空白对照组,每组10只,在造模成功后给药组分别给予石榴花乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位提取物250 mg·kg-1,阳性对照组给予二甲双胍200 mg·kg-1,空白对照组、模型对照组给予同体积蒸馏水,每日1次,连续给药4周。
2.1.3 血糖测定分别于给药前和给药4周后禁食12 h,尾静脉采血测定FPG。
2.1.4 生化指标测定给药d 28进行腹主动脉取血,室温静置2 h后,室温3 500 r·min-1离心分离血清,分装后于-80 ℃保存用于生化指标的测定。根据试剂盒说明书测定血清中GSP、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GSH、MDA含量,ELISA方法测定FINS,并采用李光伟计算方法计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)和胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment-insulin resistance index,HOMA-IR),ISI=Ln[1/(FPG·FINS)][5],HOMA-IR=FPG·FINS/22.5[6]。
2.2 细胞实验 2.2.1 胰岛素抵抗(IR)模型的建立用0.1%的明胶包被培养瓶,使用10% FBS的DMEM高糖培养基将3T3-L1前脂肪细胞培养于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中,待细胞长至80%~90%时更换培养液,细胞融合48 h后更换诱导液Ⅰ(含0.5 mmol·L-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤、1 μmmol·L-1地塞米松、10 mg·L-1牛胰岛素的完全培养基)培养96 h,诱导分化培养基Ⅱ(含10 mg·L-1牛胰岛素的完全培养基)培养48 h,完全培养基培养48 h至细胞分化为成熟的脂肪细胞,80%~90%细胞分化成功后将细胞分别接种于6孔板、96孔板,待细胞贴壁后,加入含1 μmmol·L-1地塞米松的完全培养基培养96 h[7],每48 h更换培养基。
2.2.2 分组及给药按2.2.1中方法分化、接种细胞,空白对照组以完全培养基培养细胞,模型对照组、阳性对照组及给药组给予含1 μmmol·L-1地塞米松的完全培养基,同时,阳性对照组给予10 μmol·L-1罗格列酮,给药组分别给予不同浓度石榴花总提物、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物。
2.2.3 成熟脂肪细胞的鉴定油红O染色法鉴定成熟的脂肪细胞。弃旧培养基,PBS洗2次,加入4%多聚甲醛固定液固定25 min,弃去固定液,蒸馏水洗2次,60%异丙醇浸洗5 min至间质清晰,弃异丙醇,加入油红O染色液浸染15 min,弃染色液,蒸馏水洗2~5次至无多余油红O染色液,加入蒸馏水覆盖细胞,显微镜下观察与鉴定。
2.2.4 细胞活力测定按2.2.1中方法分化、接种细胞于96孔板中,待其贴壁后分别给予0、5、10、20、40、80 mg·L-1石榴花乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物培养96 h,每48 h换液1次,每个浓度4个复孔,给药96 h后用CCK-8试剂盒测定细胞活力。
2.2.5 细胞葡萄糖消耗量测定按2.3.1中方法分化、接种细胞于96孔板中,建立胰岛素抵抗模型,给药组给予5、10、20 mg·L-1石榴花乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物,每48 h换液1次,每个浓度4个复孔,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定给药0、96 h时上清液中葡萄糖含量,葡萄糖消耗量=葡萄糖含量0 h-葡萄糖含量96 h。
2.2.6 Western blot方法测定细胞中蛋白表达IR模型3T3-L1脂肪细胞给药20 mg·L-1后弃旧培养基,PBS洗2次,用含1 mmol·L-1 PMSF和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min,1 000 g,4 ℃离心5 min,取上清,BCA法测定蛋白浓度,加入loading buffer于-20 ℃保存。用时取各组30 μg蛋白样品上样,10% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白,转至PVDF膜,5%脱脂奶粉或BSA室温摇床封闭1 h,Akt(1 :2 000)、p-Akt(1 :5 000)、PPARγ(1 :2 000)、PI3K(1 :5 000)、Glut4(1 :300)、β-actin(1 :5 000)抗体4 ℃孵育过夜,TBST洗3次,每次10 min,抗鼠(1 :10 000)或抗兔(1 :5 000)二抗室温摇床孵育1 h,TBST洗8~12次以减少背景干扰,每次5 min,ECL化学发光法显影,拍照,以上实验均进行3次重复后,以β-actin作为内参,ImageJ软件进行光密度值分析。
2.3 数据统计以上数据用x±s, n表示,采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析。
3 结果 3.1 石榴花不同萃取部位提取物对2型糖尿病大鼠的影响 3.1.1 石榴花不同萃取部位提取物对2型糖尿病大鼠体质量的影响给药前,正常饮食大鼠体质量显著高于高脂饮食大鼠(P<0.01),2型糖尿病大鼠间体质量无显著差异(Fig 1A, B);与给药前相比,给药4周后,模型组、阳性组、乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组大鼠体质量分别降低14.16%、7.20%、8.78%、7.96%,空白组、水部位组大鼠体质量分别上升6.61%、4.67%,阳性药Met、乙酸乙酯部位、正丁醇部位提取物能一定程度上减轻2型糖尿病导致的体质量降低,水部位组相较于模型组大鼠体质量显著上升(P<0.05)。
3.1.2 石榴花不同萃取部位提取物改善糖代谢和胰岛素抵抗作用模型组大鼠较空白组血糖显著上升(P<0.01),给药前,各组2型糖尿病大鼠的血糖无显著差异,给药4周后,阳性组、乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组、水部位组较模型组分别降低43.16%、11.67%、31.63%、9.77%,其中阳性组和正丁醇部位组大鼠血糖显著降低(P<0.01)。对于采样前1~3周的大鼠血糖水平,采用了糖化血清蛋白(GSP)评价,模型组GSP水平相比于空白组显著上升(P<0.01);与模型组相比,阳性组、正丁醇部位组、水部位组大鼠GSP水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。
2型糖尿病引起模型组大鼠血清胰岛素(FINS)水平、胰岛素敏感指数(ISI)相较于空白组显著降低(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,各给药组大鼠FINS、ISI显著下降(P<0.01)。同时,与空白组相比,模型组大鼠胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)显著上升(P<0.01);各给药组HOMA-IR显著下降(P<0.01),见Tab 1。
Group | FPG/mmol·L-1 | FINS/mIU·L-1 | GSP/mmol·L-1 | HOMA-IR | ISI |
Con | 3.85±0.57 | 47.94±3.43 | 0.62±0.17 | 8.24±1.63 | -5.20±0.20 |
T2DM | 20.99±2.01** | 42.00±6.69* | 1.14±0.40** | 39.24±7.81** | -6.77±0.20** |
Met | 11.93±2.34 | 21.62±6.39## | 0.79±0.32# | 11.40±3.91## | -5.50±0.33## |
EtoAC | 18.54±2.98 | 22.11±4.97## | 0.99±0.36 | 18.64±7.02## | -5.98±0.34## |
N-BAI | 14.35±1.29## | 28.32±3.79## | 0.81±0.16## | 18.04±2.78## | -6.00±0.16## |
Water | 18.94±2.11 | 23.68±7.25## | 0.71±0.29## | 19.71±6.18## | -5.92±0.55## |
*P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs type 2 diabetic model. |
由于长期的高脂饮食,模型组大鼠的TC、TG、HDL-C水平显著高于空白组(P<0.01),给药4周后,各给药组相比于模型组血脂有不同程度的降低(Fig 1C),二甲双胍组、正丁醇部位组、水部位组TC水平显著降低(P<0.05),正丁醇部位组、水部位组TG水平显著降低(P<0.01),各给药组HDL-C水平显著降低(P<0.01),LDL-C水平各组间无显著差异。
3.1.4 石榴花不同萃取部位提取物降低2型糖尿病大鼠氧化损伤水平与空白组相比,模型组大鼠的GSH、MDA水平显著上升(P<0.01),在给药4周后,正丁醇部位组和水部位组GSH水平较模型组显著下降(P<0.01),各给药组与模型组相比MDA水平显著下降(P<0.01),其中正丁醇部位组降至低于空白组大鼠的MDA水平,见Fig 1D。
3.2 石榴花不同萃取部位提取物对胰岛素抵抗的3T3-L1前脂肪细胞的影响 3.2.1 3T3-L1前脂肪细胞分化后形态变化3T3-L1前脂肪细胞分化前呈梭形,为成纤维细胞形态(Fig 2Aa);分化后细胞形状变圆,体积变大,细胞核周围有大量脂滴环绕(Fig 2Ab),在分化结束后分化率达85%~95%;油红O染色后的细胞细胞核周的脂滴被染成红色(Fig 2Ac)。
3.2.2 石榴花不同萃取部位提取物对3T3-L1脂肪细胞活力的影响细胞分化成功后分别给予石榴花不同萃取部位提取物,给药96 h后测定细胞活力发现:40 mg·L-1乙酸乙酯部位提取物能显著降低3T3-L1脂肪细胞的细胞活力(P<0.05),40 mg·L-1总提物、水部位提取物能显著降低3T3-L1脂肪细胞的细胞活力(P<0.01);80 mg·L-1总提物、乙酸乙酯部位提取物、水部位提取物能显著降低3T3-L1脂肪细胞的细胞活力(P<0.01);正丁醇部位提取物对3T3-L1脂肪细胞的细胞活力无显著影响(P<0.05),见Fig 2B。
3.2.3 石榴花不同萃取部位提取物对胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量的影响用地塞米松诱导建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型后,3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖消耗量显著降低(P<0.01),在给予石榴花各萃取部位不同剂量干预后,细胞葡萄糖消耗量出现不同程度的增加,罗格列酮组、乙酸乙酯部位高剂量组、正丁醇部位高剂量组、水部位高剂量组(Fig 2C)细胞葡萄糖消耗量显著上升(P<0.01),其中实验组以正丁醇部位提取物高剂量组对细胞葡萄糖消耗量的提高最为明显,与模型组相比,提高55.77%葡萄糖消耗量。总提物组细胞葡萄糖消耗量也有上升趋势,但无统计学差异。
3.2.4 石榴花不同萃取部位提取物对胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞相关蛋白表达的影响与空白组相比,模型组细胞PPARγ蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组相比,罗格列酮组、水部位组细胞PPARγ蛋白表达显著上升(P<0.01),见Fig 2E。
各组细胞总Akt蛋白表达无显著差异(P<0.05),与空白组相比,模型组细胞p-Akt蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组相比,罗格列酮组、正丁醇部位组、水部位组p-Akt蛋白表达显著上升(P < 0.01);p-Akt与总Akt蛋白表达的比值趋势与p-Akt蛋白表达一致, 见Fig 2F。
与空白组相比,模型组细胞PI3K、Glut4蛋白表达显著下降(P < 0.01);与模型组相比,罗格列酮组、乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组PI3K、Glut4蛋白表达显著上升(P<0.01),见Fig 2E。
4 讨论2型糖尿病以胰岛素抵抗、胰岛素相对不足为主要特征,与高脂血症、多囊卵巢综合症、动脉粥样硬化等多种疾病密切相关[8],改善胰岛素抵抗是治疗2型糖尿病的关键。石榴花在现代医学中的研究主要用于抗2型糖尿病,研究表明,石榴花中punicatannins A、punicatannins B两种成分能够抑制葡萄糖苷酶活性[9],石榴花甲醇提取物能提高胰岛素敏感性[10]。
在本研究探讨了石榴花不同萃取部位的提取物的2型糖尿病大鼠和胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞的影响,模型组大鼠较空白组大鼠空腹血糖升高而FINS水平降低,给药组大鼠较模型组大鼠血糖降低而FINS水平降低,说明给药后大鼠机体对胰岛素的利用率提高,胰岛素抵抗程度得到改善;对于胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞,石榴花不同部位提取物能够不同程度地提高其葡萄糖摄取量,提高PPARγ、p-Akt/Akt、PI3K、Glut4蛋白的表达。不同部位提取物对2型糖尿病的功效和机制略有不同,其中正丁醇部位提取物降糖、提高葡萄糖摄取量的作用最佳;而与其他部位提取物不同,水部位的作用机制为激活PPARγ受体,增强机体对胰岛素的敏感性,并且使2型糖尿病大鼠体质量显著上升。
PI3K/Akt信号通路与体内糖脂代谢的调节密切相关,是胰岛素调节血糖平衡的关键途径之一,PI3K和Akt分子表达的增强能够启动PI3K/Akt通路的传导,作用于葡萄糖转运体4(glucose transporters-4,Glut4)等多个底物受体分子,介导葡萄糖转运入细胞,促进葡萄糖的利用。反之,若机体出现PI3K/Akt信号通路传导障碍,则会导致机体糖脂代谢异常,引起胰岛素抵抗[11]。Akt又称为蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),其C端调节域含有磷酸化位点Ser473,激活Akt磷酸化位点Ser473是活化Akt所必需的[12]。石榴花提取物能够活化PI3K/Akt信号通路,改善细胞胰岛素抵抗状态。
PPARγ在成熟脂肪组织中高度表达,与脂肪细胞的分化和胰岛素敏感度的调节关系密切[13],激活PPARγ能够促进PI3K的表达,增强机体对胰岛素的敏感性,提高Glut4的表达,促进葡萄糖转运和摄取;同时,激活PPARγ还能促进前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,引起肥胖等副作用。石榴花水部位提取物降糖的作用机制为激活PPARγ,在降糖的同时也使2型糖尿病大鼠的体质量显著上升。
石榴花不同部位提取物对胰岛素抵抗的效果和机制各有不同,其中药效以正丁醇部位效果最佳,水部位次之,其降糖的作用机制主要为活化PI3K/Akt信号通路、激活PPARγ,改善胰岛素状态,提高胰岛素敏感性,促进葡萄糖转运,提高葡萄糖利用率。正丁醇部位提取物能够改善胰岛素抵抗而无体质量增加、肥胖的副作用,是未来石榴花降糖活性成分研究的重要方向。
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