2. 上海中医药大学药物安全评价研究中心, 上海 201203
2. Research Center for Drug Safety Evaluation, Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China
山豆根(Radix et Rhizome Sophorae Tonkinensis, RRST), 为豆科植物越南槐(Sophora tonkinensis Gane)的干燥根和根茎, 主要产于广西和贵州等地, 其运用历史已超过千年。山豆根药性苦寒, 有毒, 归肺、胃经, 功效清热解毒, 消肿利咽[1], 具有较好的抗炎作用。化学成分分析结果表明, 山豆根主要含有苦参碱(matrine)及氧化苦参碱(oxymatrine)等生物碱[2], 已有文献报道山豆根对小鼠耳肿胀可以显著抑制急性炎症引起的毛细血管通透性增高、炎性渗出及组织水肿, 对大鼠肉芽肿炎症后期肉芽组织的增生有较好的抑制作用, 这表明山豆根中所含生物碱具有直接抗炎作用[3]。
本研究采用角叉菜胶致大鼠足跖肿胀试验观察山豆根的抗炎作用时-效关系, 并同时检测其对炎症因子水平的影响, 探讨山豆根水提物抗炎的作用及与苦参碱体内血药浓度变化的相关性。
1 材料与方法 1.1 动物及饲养条件SPF级SD大鼠, 雄性, 体质量(150~180) g, 购自浙江维通利华试验动物技术有限公司, 生产许可证号:SCXK(浙)2018-0001, 动物合格证号:33000800002240, 质量检测单位:北京维通利华试验动物技术有限公司。饲养环境普通级, 温度(20~24) ℃, 相对湿度40%~70%, 适应性饲养3 d后进行试验。本试验动物饲养于上海市食品药品检验所动物房。
1.2 药物、试剂及配制山豆根, 购自广西宏锃药业有限公司, 产地:广西靖西县, 批号:20190307。山豆根水提浸膏粉由上海中药制药技术有限公司提取:以药材:水=1 :6的比例加水浸泡30 min, 武火煮沸后, 文火煎煮1 h, 用200目筛网过滤药渣, 收集滤液。药渣同前煎煮再次收集滤液。滤液70 ℃旋转蒸发浓缩至略微粘稠状, 75 ℃真空干燥, 得浸膏粉, 每克浸膏粉相当于6.657 g生药, 经检测其中苦参碱含量为2.17%, 氧化苦参碱含量为2.69%。氢化可的松(中国食品药品检定研究院, 规格:约50 mg/瓶, 批号100152-201707);角叉菜胶(生产商:Sigma-Aldrich, CAS:9000-07-1, 批号:SLBL6067V); TNF-α、IL-1β及IL-6 ELISA试剂盒, 购自信裕生物科技有限公司(批号:TNF-α XY-E30635, IL-1β XY-E30419, IL-6 XY-E30646);苦参碱对照品(中国食品药品检定研究院, 批号110805-201709);西咪替丁对照品(中国食品药品检定研究院, 批号100158-201406);甲酸和乙腈为色谱纯, 超纯水为实验室自制。
1.3 仪器自制足跖容积测量仪; API 5000 LC/MS/MS三重四级杆液质联用仪(AB SCIEX), 酶标分析仪(DNM9602, 北京普朗技术有限公司)。
1.4 方法 1.4.1 山豆根对大鼠足跖肿胀的抗炎作用取雄性SD大鼠44只, 分为4组, 分别为空白对照组(Control)、氢化可的松组(Hydrocortisone)、山豆根水提浸膏粉高剂量组(RRST-H)和低剂量组(RRST-L)。氢化可的松组灌胃给予40 mg·kg-1氢化可的松, 山豆根水提浸膏粉高、低剂量组分别灌胃给予生药0.6 g·kg-1和生药0.3 g·kg-1山豆根水提浸膏粉溶液, 给药体积为20 mL·kg-1, 空白对照组给予同体积纯水, 每日给药1次, 连续3日。
末次给药后1 h, 大鼠右后足跖皮下注射质量分数为1%的角叉菜胶溶液0.1 mL致炎, 测定致炎前和致炎后0.5、1、2与3 h时的大鼠右后足跖容积, 并计算肿胀率, 肿胀度与肿胀率计算公式如下:
肿胀度=致炎后足跖容积-致炎前足跖容积
肿胀率/%=肿胀值/致炎前足跖容积×100%。
末次测定足跖容积后, 各组大鼠致炎侧后足自踝关节上5 mm处截取足爪组织制备匀浆液, 按ELISA试剂盒说明书检测致炎组织中的炎症因子:TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。
1.4.2 山豆根药代动力学参数取雄性SD大鼠10只, 分为2组, 分别为山豆根水提浸膏粉高剂量组和低剂量组。给药剂量、给药周期同抗炎作用试验, 于末次给药前和给药后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8和24 h, 经眼眶后静脉丛取血约0.5 mL, EDTA-2K抗凝管4 ℃离心(3 000 r·min-1, 15 min), 分取血浆, 采用LC/MS/MS检测山豆根抗炎作用伴随药代动力学研究药代参数AUC(0-t)、Cmax、Tmax、T1/2。
色谱分析条件Waters XBridge Amide色谱柱(4.6×100 mm, 3.5 μm), 0.1%甲酸溶液-乙腈=60:40(V/V)为流动相; 柱温40 ℃; 流速0.5 mL·min-1; 自动进样器温度设置为10 ℃; 进样量2 μL。
质谱分析条件采用电喷雾离子源(ESI), 正离子方式监测。离子源喷雾电压(IS):5 500 V; 温度:450 ℃; 源内气体1(GS1, N2)压力:45 psi; 气体2(GS2, N2)压力: 45 psi; 气帘气体(N2)压力:30 psi; 碰撞气(CAD, N2)压力:4;扫描方式为多反应监测(MRM); 用于定量分析的离子反应分别为m/z 249.3→m/z 148.2(苦参碱)、m/z 265.1→m/z 247.1氧化苦参碱和m/z 253.1→m/z 159.1(内标), 去簇电压(DP)为140 V, 射入电压(EP)为10 V, 碰撞能量(CE)分别为46 eV(苦参碱)、40 eV(氧化苦参碱)和20 eV(内标), 碰撞室射出电压(CXP)为20 V。
血浆样品的处理取血浆100 μL, 加入西咪替丁内标溶液(1 mg·L-1)10 μL, 加入乙腈300 μL, 涡旋3 min, 20 000 r·min-1离心10 min。取上清200 μL进样。
1.5 统计学分析动物体质量、肿胀率及炎症因子均采用SPSS 19.0进行单因素方差分析, 在方差齐的情况下, 进一步采用Dunnett-t检验进行与空白对照组的组间比较, 各组试验结果均以x±s表示。对非正态性分布或方差不齐的数据采用秩和检验。药代动力学参数采用DAS软件进行分析。
2 结果 2.1 动物体质量及一般症状试验期间各组动物活动均正常, 未见异常体征及动物死亡。动物初始体质量、终末体质量组间均未见显著性差异, 见Tab 1。
| Days | Control/g | Hydrocortisone/g | RRST-H/g | RRST-L/g |
| 1 | 171.9±9.5 | 169.7±13.9 | 170.7±11.1 | 170.2±8.3 |
| 3 | 188.3±7.8 | 183.8±12.3 | 185.8±14.2 | 186.0±9.8 |
致炎之前, 各组大鼠足跖基础容积组间比较差异无统计学意义。致炎后, 与空白对照组相比, 氢化可的松组大鼠在0.5、1、2和3 h时的足跖肿胀率明显降低(P＜0.01);山豆根水提浸膏粉高剂量组和低剂量组大鼠在0.5、1、2和3 h时的足跖肿胀率亦明显降低(P＜0.05), 见Tab 2。
| Time/h | Control/% | Hydrocortisone/% | RRST-H/% | RRST-L/% |
| 0.5 | 26.59±7.24 | 9.92±5.18** | 10.78±4.80** | 16.86±6.05* |
| 1 | 28.30±6.89 | 9.97±5.27** | 10.52±4.11** | 19.71±4.68* |
| 2 | 26.53±6.49 | 3.52±2.27** | 6.74±4.25** | 15.32±4.21** |
| 3 | 18.41±5.45 | 1.22±0.94** | 4.35±3.14** | 12.55±3.63* |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs control | ||||
山豆根水提浸膏粉高低剂量组大鼠体内苦参碱含量呈剂量依赖性, 高剂量组大鼠体内苦参碱AUC值约为低剂量组大鼠体内AUC值的两倍, Tmax为1 h左右, 半衰期为2 h左右, 24 h体内苦参碱消失殆尽, 见Tab 3。
| Group | AUC(0-t)/μg·L-1·h-1 | Cmax/μg·L-1 | Tmax/h | T1/2/h |
| RRST-H | 1 377.16±255.76 | 399.6±59.2 | 1.2±0.4 | 2.04±0.44 |
| RRST-L | 630.89±180.45 | 193.4±39.6 | 1±0 | 2.12±0.80 |
与空白对照组比较, 氢化可的松组、山豆根水提浸膏粉高、低剂量组大鼠足跖肿胀组织的TNF-α及IL-1β水平均明显降低(P＜0.01);氢化可的松组和山豆根水提浸膏粉高剂量组大鼠足跖肿胀组织IL-6水平显著降低(P＜0.01), 见Tab 4。
| Group | Dose/kg-1 | TNF-α/ng·g-1 | IL-1β/ng·g-1 | IL-6/ng·g-1 |
| Control | - | 12.04±1.49 | 155.84±23.75 | 47.35±7.01 |
| Hydrocortisone | 40 mg | 8.47±1.79** | 116.03±12.70** | 35.21±3.24** |
| RRST-H | 0.6 g | 9.09±1.07** | 120.40±11.69** | 36.12±7.41** |
| RRST-L | 0.3 g | 10.07±0.90** | 131.43±14.87** | 41.05±4.83 |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs control | ||||
山豆根为使用历史悠久的传统中药材, 因其丰富的药用功能备受关注。山豆根临床常用于预防及治疗咽喉炎、扁桃体炎等疾病[4], 亦可以用于治疗慢性乙型肝炎、慢性活动性肝炎及肝癌的辅助性治疗[5]。山豆根治疗咽喉疾病及发挥保肝药效均与其调节炎症因子的表达有关[6]。在抗炎作用研究方面, 已有文献报道山豆根对多种炎症模型均显示明显的抑制作用, 如山豆根对二甲苯致小鼠耳肿胀模型能明显降低耳肿胀度, 对巴豆油所致小鼠耳肿胀和琼脂所致小鼠肉芽肿亦有较强的抑制作用[7], 对小鼠腹腔毛细血管通透性以及组织胺所致的大鼠皮肤毛细血管通透性模型均有明显的抑制作用[8]。但山豆根对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型的抗炎药效未见报道。
山豆根的化学成分主要有生物碱、多糖、黄酮类化合物[9-10], 其中生物碱是山豆根的主要活性成分[2], 包括苦参碱、氧化苦参碱及槐果碱。有文献已报道山豆根化学成分苦参碱、氧化苦参碱在大鼠、犬、食蟹猴体内的药代动力学特征[11-13], 但上述药代动力学研究均是以苦参碱和/或氧化苦参碱单体成分进行的体内药代动力学研究, 未见山豆根提取物混合组分进行的药代动力学特征研究。另外, 本研究结合山豆根抗炎药效同步进行药代动力学研究, 基于血浆苦参碱和氧化苦参碱血药浓度的变化考察山豆根抗炎药效时-效关系, 同时, 考察山豆根发挥抗炎药效作用时炎症因子的表达, 形成“抗炎药效-血药浓度-炎症机制”三维整合研究的新思路, 揭示山豆根发挥抗炎药效的时效关系作用机制。
本研究采用角叉菜胶致大鼠足趾肿胀考察山豆根的抗炎作用。2015版《中国药典》一部中, 山豆根临床用量为3~6 g[1], 按成人平均体重60 kg计算, 人临床用药量为0.05~0.1 g·kg-1, 大鼠等效剂量为0.3~0.6 g·kg-1。本研究动物试验药效剂量设计以《中国药典》人临床日用剂量上下线的等效剂量作为大鼠药效高、低两个剂量, 通过测定大鼠足跖肿胀率, 结果显示上述等效剂量范围内的山豆根水提浸膏粉均可明显抑制角叉菜胶致大鼠足跖的肿胀度。
在山豆根抗炎作用时-效关系研究中, 氢化可的松组在角叉菜胶致炎后0.5、1、2与3 h时大鼠肿胀率非常显著降低, 山豆根水提浸膏粉高、低剂量组亦在致炎后0.5、1、2与3 h时大鼠肿胀率显著降低, 显示山豆根水提浸膏粉高、低剂量组均具有较强的抗炎作用, 且高剂量抗炎作用强于低剂量。在抗炎药效同步进行的药代动力学研究中, 本研究检测了血浆苦参碱和氧化苦参碱的血药浓度, 结果发现氧化苦参碱体内血药浓度较低, 接近生物分析定量限, 结合本研究检测山豆根药材中苦参碱含量为2.17%, 氧化苦参碱含量为2.69%, 两个成分含量均较低, 吸收入血后, 根据文献报道氧化苦参碱可在肠道菌的作用下代谢为更易吸收的苦参碱, 苦参碱有着较高的生物利用度, 较易吸收入血[13, 14], 体内氧化苦参碱的含量会进一步降低, 其检测结果接近生物分析定量限, 存在定量不准确的因素, 因此本研究药代动力学参数的统计以苦参碱计。药代动力学参数结果显示山豆根水提浸膏粉高剂量组大鼠体内苦参碱AUC值约为低剂量组的两倍, 且高剂量组对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀率的抑制作用明显强于低剂量组; 大鼠体内苦参碱Tmax为1 h左右, 山豆根水提浸膏粉组大鼠足跖肿胀率也于1 h左右达到高峰后开始下降, 说明山豆根水提浸膏粉对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀率的影响与大鼠体内苦参碱血药浓度具有高度相关性, 提示苦参碱可以作为山豆根水提浸膏粉抗炎作用的标志性物质。
在抗炎作用炎症因子的检测中, 本研究对末次测定足趾容积后肿胀组织TNF-α、IL-1β和IL-6含量进行了测定。细胞因子是由多种组织细胞所合成和分泌的具有生物活性的小分子多肽或糖蛋白, 主要包括肿瘤坏死因子和白细胞介素等[15]。TNF-α不仅具有很强的致炎活性, 还可以刺激受损伤的组织细胞释放白细胞介素等炎症因子, 进而诱导并放大损伤的炎症反应[16]。早期炎症的致炎因子IL-1β可以与TNF-α共同激活诸多免疫和炎症细胞, 促进炎症的进一步发展, 进而调控和诱导其他炎症因子的分泌与释放。IL-6具有多种功能, 如调节免疫系统、造血系统, 参与急性相反应及炎症反应过程, 易被一系列炎症刺激及炎症介质所诱导, 如TNF-α和IL-1等, 也是参与先天免疫(非条件免疫)的一种重要炎症介质。本研究发现, 经角叉菜胶诱发炎症反应后, 山豆根水提浸膏粉可显著下调致炎大鼠足跖肿胀组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量, 从而减轻炎症反应的程度, 且高剂量组炎症因子的含量低于低剂量组, 提示剂量越高, 抑制炎症因子的表达作用越好, 抗炎作用越强, 结合药代动力学研究结果, 剂量越高, 体内苦参碱系统暴露量越大, 抗炎作用越强。本研究从“抗炎药效-血药浓度-炎症机制”三个方面整合, 综合评价山豆根抗炎药效时效关系的作用机制, 进一步明确了山豆根的抗炎作用。
本研究基于药代动力学的药效研究确定发挥疗效的最低剂量, 同理, 基于毒代动力学的毒理研究确定不产生毒性的最高剂量, 由此为制定“有毒”中药的安全剂量范围, 为药典制定“有毒”中药可测定成分含量及推荐安全剂量提供参考, 为修订和提升“有毒”中药材的质量评价标准提供数据依据。
| [1] |
国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[S].北京: 化学工业出版社, 2015: 27. Chinese Pharmacopocia Commission. Pharmacopoeia of the people's republic of China volume Ⅰ[S]. Beijing: Chem Ind Press, 2015: 27. |
| [2] |
韩馥蔓, 王莉鑫, 陈影, 等. HPLC同时测定山豆根中7种生物碱及3种黄酮的含量[J]. 中国中药杂志, 2016, 41(24): 4628-34. Hang F M, Wang L X, Chen Y, et al. Simultaneous determination of seven alkaloids and three flavonoids in Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma by HPLC[J]. Chin J Hosp Pharm, 2016, 41(24): 4628-34. |
| [3] |
谢世荣, 黄彩云, 黄胜英, 等. 山豆根碱抗炎作用的研究[J]. 中草药, 2003, 34(4): 355-7. Xie S R, Huang C Y, Huang S Y, et al. Anti-inflammatory effect of dauricine[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2003, 34(4): 355-7. doi:10.3321/j.issn:0253-2670.2003.04.028 |
| [4] |
吕美玲, 黄智锋, 陈琳婧, 等. 某院495张含山豆根饮片处方的用药分析[J]. 世界中西医结合杂志, 2016, 11(9): 1238-40. Lyu M L, Huang Z F, Chen L J, et al. Analysis on 495 prescriptions with Sophorae Tonkinensis et Rhizoma[J]. World J Integr Trad West Med, 2016, 11(9): 1238-40. |
| [5] |
杨雪, 夏东胜, 高建超, 等. 578例山豆根不良反应文献分析[J]. 中国药物警戒, 2017, 14(4): 235-41. Yang X, Xia D S, Gao J C, et al. Literature analysis of 578 cases of adverse drug reactions induced by Sophora Tonkinensis Gagnep[J]. Chin J Pharmacov, 2017, 14(4): 235-41. |
| [6] |
Qian H. Sophocarpine attenuates liver fibrosis by inhibiting the TLR4 signaling pathway in rats[J]. World J Gastroentero, 2014, 20(7): 1822. doi:10.3748/wjg.v20.i7.1822 |
| [7] |
李晓宇, 栾永福, 李晓骄阳, 等. 山豆根不同组分抗炎及伴随毒副作用研究[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(15): 2232-7. Li X Y, Luan Y F, Li X J Y, et al. Study on anti-inflammatory efficacy accompanied by side effects of different components of Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma[J]. Chin J Hosp Pharm, 2012, 37(15): 2232-7. |
| [8] |
杜士明, 周本宏, 扬光义. 山豆根水提物抗炎作用研究[J]. 中国药房, 2008, 19(18): 1371-2. Du S M, Zhou B H, Yang G Y. Anti-inflammatory effect of theaqueous extracts from Sophorae Tonkinensison[J]. Chin Pharm, 2008, 19(18): 1371-2. |
| [9] |
Pan Q M, Zhang G J, Huang R Z, et al. Cytisine-type alkaloids and flavonoids from the rhizomes of Sophora Tonkinensis[J]. J Asian Nat Prod Res, 2016, 18(5): 429-35. doi:10.1080/10286020.2015.1131680 |
| [10] |
张媛媛, 郭智勇, 谢国祥, 等. 山豆根非生物碱部分质量控制方法研究[J]. 中药材, 2008, 31(11): 1730-4. Zhang Y Y, Guo Z Y, Xie G X, et al. Quality control of non-alkaloids from Radix Sophorae Tonkinensis[J]. J Chin Med Mater, 2008, 31(11): 1730-4. doi:10.3321/j.issn:1001-4454.2008.11.044 |
| [11] |
赵晨光, 廖丹丹, 何小燕, 等. 苦参碱肌肉注射给药在大鼠体内的药动学研究[J]. 中国中药杂志, 2010, 25(10): 1315-8. Zhao C G, Liao D D, He X Y, et al. Study on pharmacokinetics of matrine by intramuscular administration in rat[J]. Chin J Hosp Pharm, 2010, 25(10): 1315-8. |
| [12] |
刘苏, 秦晶, 陆伟根, 等. 氧化苦参碱在大鼠体内药代动力学特征[J]. 中成药, 2011, 33(6): 962-5. Liu S, Qin J, Lu W G, et al. Pharmacokinetics of oxymatrine in rats[J]. Chin Trad Pat Med, 2011, 33(6): 962-5. |
| [13] |
王素军, 王广基, 李晓天, 等. 氧化苦参碱缓释片在犬体内的代谢及其相对生物利用度[J]. 中国药学杂志, 2008, 43(2): 129-31. Wang S J, Wang G J, Li X T, et al. Metabolism and relative B ioavailability of oxymatrine sustained-release tablets in beagle dogs[J]. Chin Pharm J, 2008, 43(2): 129-31. |
| [14] |
高佩佩, 王珍, 刘静, 等. 氧化苦参碱的药代动力学、毒理学及药理作用[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(7): 898-902. Gao P P, Wang Z, Liu J, et al. The pharmacokinetics, toxicology and pharmacology of oxymatrine[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(7): 898-902. |
| [15] |
张文华, 江剑平. 白介素-1β在炎性痛中的作用及其机制[J]. 生命科学, 2010, 22(3): 291-4. Zhang W H, Jiang J P. Roles and mechanisms of interleukin-1β during inflammatory pain[J]. Chin Bull Life Sci, 2010, 22(3): 291-4. |
| [16] |
杨玉琳, 陶文剑, 唐宗湘, 等. 针刺通过降低TNF-α表达缓解脂多糖诱导的炎性痛[J]. 南京医科大学学报(自然科学版), 2017, 37(3): 303-6. Yang Y L, Tao W J, Tang Z X, et al. Acupuncture relieves lipopolysaccharide (LPS) induced inflammatory pain by deregulating of TNF-α[J]. Acta Univ Med Nanjing(Nat Sci), 2017, 37(3): 303-6. |