黄芩苷和小檗碱分别是清热解毒药黄芩和黄连及其复方口服后主要的入血成分[1]，二者体内外实验均表现出良好的抗炎活性[2, 3]，但联合应用的合理性研究还未见报道。本实验研究黄芩苷和小檗碱联合对经典炎症通路关键节点的影响，评价二者合用相关机制。
1 材料 1.1 细胞小鼠腹腔巨噬细胞株(RAW 264.7)，购自中国科学院细胞库。
1.2 药物与试剂黄芩苷(批号AF7061702)、盐酸小檗碱(批号AF8011015)、穿心莲内酯(批号AF7072353)，购自成都埃法生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒(批号A28281022)、白介素-6(IL-6)检测试剂盒(批号A20680724)，购自联科生物技术有限公司；一氧化氮(NO)检测试剂盒(批号S0021，碧云天生物研究所)；磷酸化蛋白核因子κB p65(phospho- nuclear factor kappa B p65，p-p65)、p65、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗体(美国Cell Signaling公司)。
1.3 仪器AE2000双目显微镜(Motic)；二氧化碳培养箱、酶标仪(Thermo Scientific)；蛋白垂直电泳仪(Bio-Rad)。
| Drugs | Concentration/μmol·L-1 | ||||||
| D1 | D2 | D3 | D4 | D5 | D6 | D7 | |
| Bai.+Ber. | 2.05+0.042 | 4.1+0.085 | 8.25+0.17 | 16.5+0.34 | 33+0.68 | 66+1.35 | 132+2.7 |
| Bai. | 2.05 | 4.1 | 8.25 | 16.5 | 33 | 66 | 132 |
| Ber. | 0.042 | 0.085 | 0.17 | 0.34 | 0.68 | 1.35 | 2.7 |
| Bai: baicalin. Ber: berberine. | |||||||
采用DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)培养RAW 264.7细胞。
2.2 细胞分组、给药、取样及炎症关键指标的检测取对数生长期细胞于24孔板，分组含：空白对照组、模型组(LPS=100 ng·mL-1)、阳性药物组(LPS+穿心莲内酯10 μmol·L-1)、各剂量给药组(LPS+联合药物、LPS+黄芩苷、LPS+小檗碱)，给药浓度见表 1。给药30 min后除空白孔外每孔加入LPS造模，各平行板LPS分别刺激50 min、4 h、12 h后，吸取培养上清液，用于TNF-α、IL-6、NO的检测。
取对数生长期细胞于6孔板，同上方各浓度分组操作。分别于LPS刺激2 h、12 h后，提取和变性蛋白，用于p-p65、iNOS的检测。
按试剂盒说明书操作测定细胞因子水平，通过Western blot检测蛋白表达水平。
2.3 药物联合作用评价Chou-Talalay[4]的中效方程是一种能准确分析药物配伍使用效果有无协同、拮抗或加和的定量分析法，如实验数据不呈对数线性关系，以fa/fu值对剂量梯度作图，可直观得出结论。本实验对所得三组fa/fu—剂量关系图评测，评价二者的联合作用。
2.4 统计学方法通过SPSS15.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，处理组间差异性。
3 结果 3.1 蛋白表达测定结果小檗碱在实验剂量下呈剂量依赖性地抑制NF-κB的磷酸化(P < 0.05)，对iNOS表达无相关作用；而黄芩苷对NF-κB磷酸化、iNOS表达的抑制作用极微弱；fa/fu—剂量关系图显示联用对NF-κB磷酸化的抑制具有拮抗作用，对iNOS表达的抑制呈现加和作用。
3.2 细胞因子水平测定结果黄芩苷呈剂量依赖性地抑制NO的释放，最高浓度下对IL-6的释放具有一定抑制作用(P < 0.05)；小檗碱在实验剂量下对NO、IL-6的释放无相关抑制作用；二者对TNF-α均具有微弱的抑制作用；fa/fu—剂量关系图显示，二者合用对NO释放的抑制表现为加和作用，对IL-6、TNF-α释放的抑制呈现较弱的拮抗作用。
4 讨论黄芩苷和小檗碱在单味药及复方中均有良好吸收，是发挥疗效的主要物质基础，从二者合用的药效改变可探索复方的组织机理。本实验通过相关药代动力学资料[1, 5]确定黄芩苷和小檗碱的摩尔浓度配比为49 :1，以反映二者在体内出现的分子比的现实情况，对炎症通路关键节点[6, 7]的影响测定发现，黄芩苷和小檗碱联用对抑制p65磷酸化及TNF-α、IL-6释放均存在一定拮抗作用，可能由于二者结合导致扩散转运入胞内的总有效成分降低；更重要的是，两者合用时小檗碱对抑制NF-κB p65靶点起主导作用，而黄芩苷对抑制IL-6、iNOS及NO释放起主导作用，提示在复方应用中，黄芩苷和小檗碱并非通过共同干预同一靶标发挥协同作用，而是侧重于调控不同靶点，影响不同分子网络，互补调节炎症反应从而发挥网络协同效应，这可能也是中药组方配伍精髓所在。
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