2. 崇左市人民医院,药学部,广西 崇左 532200
2. Dept of Pharmacy, Chongzuo People's Hospital, Chongzuo Guangxi 532200, China
肝癌是一种高致死率的恶性肿瘤,有易耐药、易转移的特点。肝癌的远处转移也是术后复发致死的主要原因。因此,抑制肝癌细胞侵袭和转移是治疗肝癌的关键问题。
肝癌细胞的侵袭与转移是一个多步骤、多因素相互作用的复杂过程[1, 2]。肝癌细胞从原发部位浸润,破坏周围正常组织,进入血液循环完成侵袭过程,然后随着血液迁移到其他组织器官,进一步发展成继发性癌灶是肝癌细胞的转移过程。因此,抑制肝癌细胞的侵袭和转移是贯穿肿瘤恶性发展的重要步骤,同时也成为了抗肝癌转移的关键。
转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一种具有多种生物学活性的生物因子, 参与细胞的增殖、侵袭等过程[3, 4]。Smad家族蛋白是TGF-β1/Smad信号通路的底物蛋白,是将TGF-β1信号从细胞外转导到细胞核内的重要蛋白因子。SIS3作为Smad蛋白抑制剂,通过抑制TGF-β1/ Smad信号通路的下游蛋白,从而阻断TGF-β1/ Smad信号通路活性。马艳等[5]报道,TGF-β1可诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。EMT指上皮细胞和周围间质互相作用过程中获得的某些间质细胞特有表型的现象, 目前被认为是癌细胞发生侵袭和转移的关键启动步骤[6],能够使细胞的侵袭及迁移能力增强。因而,抑制癌细胞发生EMT,有利于控制肝癌细胞侵袭和转移。
目前,寻找新型抗人肝癌细胞侵袭转移的药物或天然活性物已成为提高肝癌治疗水平和改善其预后是研究的热点。中药裂果薯是一种广西特色的中草药,属壮、瑶药,其拉丁名为:Schizocapsa plantaginea Hance。裂果薯皂苷单体I(Saponin monomer I of Schizocapsa plantaginea Hance,SSPH Ⅰ)是从该植物中提取分离得到的甾体皂苷单体之一[7]。本项目组前期通过活性追踪,发现SSPH Ⅰ对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖、迁移有明显的抑制作用[8, 9],但是其抗肝癌细胞侵袭迁移是否与TGF-β1/Smad通路有关尚未见相关报道。为此,本文将通过体外人肝癌细胞培养实验,探讨SSPH Ⅰ能否通过TGF-β1/Smad调控EMT发挥抗人肝癌细胞侵袭转移的作用。旨在解决目前抗肝癌细胞侵袭、转移情况的难点问题,同时为SSPH Ⅰ作为抗肝癌新药研发提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验药物裂果薯块茎购自广西壮族自治区资源县瓜里乡,并由广西壮族自治区中医药研究院黄云峰教授鉴定为Schizocapsa plantaginea Hance, 裂果薯皂苷单体I(Saponin monomer I of Schizocapsa plantaginea Hance,SSPH Ⅰ)由本课题组提取与鉴定。取0.97 mg的SSPH Ⅰ粉末,加入970 μL的DMSO,制成970 μmol·L-1母液,4 ℃保存备用,正式实验中用细胞培养液稀释成相应浓度备用。
1.2 细胞系SMMC-7721人肝癌细胞株购自中国科学院上海细胞库并由本课题组传代培养。
1.3 实验分组实验以10 μg·L-1的TGF-β1诱导SMMC-7721细胞发生EMT,以10 μmol·L-1的SIS3阻断TGF-β1/Smad信号通路,以此作为阴性对照。实验分为6组:空白对照组、TGF-β1对照组、TGF-β1联合SIS3组、TGF-β1联合不同浓度的SSPH Ⅰ给药组。
1.4 试剂胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,货号:11011-8611);0.25%胰酶消化液、青-链霉素混合液、磷酸盐(PBS)缓冲液、MTT、二甲基亚砜(DMSO)(北京索莱宝科技有限公司,货号T1300-100;P1400-100;P1020-500;M8180;D8370);DMEM高糖培养基(HyClone公司,货号:C11995500BT);BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物科技有限公司, 货号:P0010S);GAPDH抗体, 重组人转化生长因子TGF-β1, Smad7抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,货号:10494-1-AP;10804-HNAC;25840-1-AP);E-cadherin,N-cadherin, Vimentin,Smad2/3,p-Smad2/3抗体,HRP标记的山羊抗兔IgG(美国CST公司,货号:3195T、13116T、5741T、5678S、8828S、5151P)。
1.5 仪器酶联免疫检测仪,二氧化碳孵箱(美国Thermo Fisher scientific公司); 超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司); 荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司); 电泳仪及转膜仪(北京六一生物科技有限公司)。
1.6 实验方法 1.6.1 MTT法检测SSPH Ⅰ对细胞增殖的影响将SMMC-7721细胞用0.25%胰酶消化,调整细胞浓度为1×106个·mL-1,接种于96孔板中,每孔100 μL,每组设6个复孔,共10组。培养箱中孵育至细胞贴壁生长至80%时,弃去培养基,加入不同浓度的SSPH Ⅰ(0.06、0.12、0.24、0.49、0.97、1.94、3.88、7.76、15.52 μmol·L-1),每孔100μL,孵育24 h后,每孔加入0.5 g·L-1的MTT溶液各100 μL孵育4 h,弃去MTT溶液,每孔加入100 μL DMSO,摇床上振摇15 min,在490 nm波长下测其OD值。细胞抑制率/%=(空白组平均值-给药组平均值)/空白组平均值×100%。以细胞增殖抑制率与给药浓度作图,求出IC50。
1.6.2 划痕实验检测SSPH Ⅰ对细胞迁移能力的影响制备单细胞悬液(1×106·mL-1),每孔100 μL接种于96孔板中,每组设置4个复孔。待细胞长至80%后,用10 μg·L-1的TGF-β1刺激细胞24 h。200 μL的枪头于正中央划痕,每孔一道,PBS洗3遍,轻轻吹打下散落的细胞。以给完药时刻作为0 h,设置拍照时间为0、24、48 h,固定同一个视野进行拍照。利用Image J软件统计各组划痕宽度。24 h细胞迁移率/%=|(24 h划痕宽度-0 h划痕宽度)|/0 h划痕宽度×100%,48 h细胞迁移率/%=|(48 h划痕宽度-0 h划痕宽度)|/0 h划痕宽度×100%。
1.6.3 Transwell小室侵袭实验检测SSPH Ⅰ对细胞侵袭能力的影响Matrigel基质胶与无血清的培养基1 :4混合稀释,每孔50 μL加入小室内,培养箱中温育1 h至基质胶凝固。将SMMC-7721单细胞悬液(1×107·mL-1)以每孔100 μL接种于小室上室中,每孔100 μL的SSPH Ⅰ药液与细胞悬液混合置于上室。下室加入800 μL含20%血清的培养基,孵育24 h,弃去培养基,PBS洗2遍,小室放入冰甲醇中固定30 min,PBS洗2~3遍,待膜完全风干后放入有800 μL 0.1%的结晶紫溶液中,染色30 min。PBS洗2~3遍,风干,然后取4个视野,20×显微镜下拍照,观察SSPH Ⅰ对细胞侵袭能力影响的情况。
1.6.4 Western blot实验以RIPA :PMSF :磷酸化抑制剂=100 :1 :1的比例配制蛋白裂解液,每孔100 μL收集细胞,冰上裂解15 min后13 000 r·min-1离心20 min, 收集上清液。用BCA试剂盒测定蛋白浓度,加蛋白上样缓冲液制样,100 ℃沸水中加热5 min使蛋白变性。按照每个泳道100 μg的蛋白量进行电泳,转膜。TBST洗膜3次,每次5 min。Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin一抗于4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次,每次5 min。室温下二抗孵育1 h。最后用近红外双色成像系统进行定量分析。
1.6.5 统计学方法所有实验重复3次,采用SPSS17.0进行统计学分析。实验结果以x±s表示。多组间样本数据均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用Newman-Keuls检验。
2 结果 2.1 SSPHⅠ抑制SMMC-7721细胞增殖MTT实验结果表明,SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721细胞增殖(Fig 1)。在24 h的IC50为1.72 μmol·L-1,可见SSPH Ⅰ对SMMC-7721细胞增殖有明显抑制作用(P < 0.01)。为了更好的观察SSPH Ⅰ对SMMC-7721细胞侵袭转移的影响,选择0.73、1.46、2.92 μmol·L-1这3个浓度进行实验研究。
2.2 SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721细胞迁移细胞划痕实验显示(Fig 2A),随着SSPH Ⅰ浓度的增加,TGF-β1+SSPH Ⅰ组细胞迁移率降低。Control组、TGF-β1组、TGF-β1+SIS3组、TGF-β1+SSPH Ⅰ(0.73、1.46、2.92 μmol·L-1)组24 h细胞迁移率分别为(19.09±3.72)%、(27.1±4.84)%、(8.32±1.6)%、(6.89±3.29)%、(6.09±2.28)%、(5.01±2.98)%。48小时细胞迁移率分别为(30.48±8.94)%、(44.74±10.02)%、(5.51±2.91)%、(9.05±5.24)%、(8.35±1.73)%、(11.86±3.95)%。与Control组相比,24 h和48 h的TGF-β 1组细胞迁移率明显升高(P < 0.05),说明TGF-β1促进细胞迁移。与TGF-β1组相比(Fig 2B, C),TGF-β1+SSPH Ⅰ组24 h和48 h的细胞迁移率明显降低(P < 0.01)。与TGF-β1+SIS3组结果相同。
2.3 SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721细胞侵袭Transwell实验结果显示(Fig 3A),SSPH Ⅰ明显抑制SMMC-7721细胞的侵袭和转移。Control组、TGF-β1组、TGF-β1+SIS3组、TGF-β1+SSPH Ⅰ(0.73、1.46、2.92 μmol·L-1)组的细胞侵袭数分别是219±55、277±48、94±30、116±39、83±40、23±14个(Fig 3B)。与Control组相比,TGF-β1组穿过基质胶与滤膜侵袭入下室的SMMC-7721细胞数明显增多(P < 0.05)。与TGF-β1组相比,TGF-β1+SSPH Ⅰ组的侵袭细胞数明显减少(P < 0.01)。与TGF-β1+SIS3组结果相同。
2.4 SSPH Ⅰ抑制TGF-β1/Smad信号通路和EMTWestern blot结果显示,与Control组相比较,TGF-β1组E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin和Vimentin蛋白表达升高(P < 0.05)。说明TGF-β1诱导SMMC-7721细胞发生EMT(Fig 5A)。同时,TGF-β1组p-Smad2/3蛋白表达增加(P < 0.05),Smad7蛋白表达降低(P < 0.01)。可见TGF-β1通过激活TGF-β1/Smad信号通路而发挥作用(Fig 4A)。与TGF-β1组相比,TGF-β1+SSPH Ⅰ组N-cadherin和Vimentin蛋白表达降低(Fig 5B),E-cadherin蛋白表达增加(Fig 5B),此外p-Smad2/3蛋白表达降低(Fig 4B),Smad7蛋白表达增加(Fig 4B)。结果与TGF-β1+SIS3组相同(P均 < 0.05)。说明SSPH Ⅰ通过阻断TGF-β1/Smad信号通路,抑制EMT的发生。
3 讨论原发性肝癌主要以肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)为主,是一种常见的高致死率的恶性肿瘤。肝癌细胞的侵袭和转移是其一个重要的生物学特性。也是术后复发致死的主要原因。细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验是反映肿瘤细胞侵袭和转移的重要指标。根据实验结果,TGF-β1组的细胞迁移率和侵袭数量较Control组明显增加,但这一作用被SSPH Ⅰ明显抑制,可见,SSPH Ⅰ能抑制SMMC-7721细胞侵袭转移, 其机制可能与抑制TGF-β1的生物学作用有关。
EMT是癌细胞恶性转化的重要因素,是很多肿瘤细胞侵袭和转移的开始[10-12],能促进癌细胞侵入其他器官,诱导转移瘤的发生。研究发现,TGF-β1能够诱导肝癌细胞发生EMT,使细胞丧失连接和极性,导致侵入性迁移间充质细胞的形成,同时伴随着细胞粘附的破坏,最终导致癌细胞转移侵入至其他正常组织。EMT的主要表现是E-cadherin表达降低,同时N-cadherin和Vimentin表达增加。根据Western blot结果,与Control组相比,TGF-β1组细胞的E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达符合上述情况,说明TGF-β1能促进细胞发生EMT效应,增强肝癌细胞侵袭转移能力。随着SSPH Ⅰ给药浓度的增加,上述蛋白效应被逆转。
TGF-β1/Smad信号通路是经典的信号传导通路[13-14]。其中TGF-β1是诱导EMT的重要生物因子。TGF-β1诱导激活TGF-β1/Smad信号通路,促进TGF-β配体结合II型受体二聚体,引起胞内Smad2和Smad3的磷酸化,与Smad4形成复合物进入细胞核,调节相应靶基因转录与表达,例如,上调N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,下调E-cadherin蛋白的表达,而这一结果最终诱导肿瘤细胞发生EMT,使癌细胞迁移和侵袭能力增强[15]。但是,TGF-β1/Smad信号通路是否在SSPH Ⅰ抑制SMMC-7721侵袭和转移中发挥重要作用,值得我们进一步验证。通过Western blot实验我们发现,TGF-β1能诱导SMMC-7721细胞发生EMT,同时激活TGF-β1/Smad信号通路,使得p-Smads2/3蛋白表达上调,同时负调控Smads7蛋白表达。但是SSPH Ⅰ给药处理细胞后,上述分子效应被阻断,肝癌细胞迁移率和侵袭数量降低。效应与TGF-β1/Smad信号通路抑制剂SIS3相同。除此之外,EMT标志性蛋白E-cadherin增加,N-cadherin和Vimentin蛋白降低。表明SSPH Ⅰ通过抑制TGF-β1/Smad阻断癌细胞EMT效应,从而达到抑制癌细胞侵袭和转移的效果。
综上所述,SSPH Ⅰ具有拮抗肝癌细胞侵袭转移的作用,其机制与介导TGF-β1/Smad信号通路,阻断EMT有关。SSPH Ⅰ作为一种新型的抗肿瘤中药,在抑制肝癌细胞侵袭转移方面具有积极的意义,这也为SSPH Ⅰ通过靶向EMT治疗肝癌细胞侵袭转移提供一定的理论实验基础。
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