脯氨酰寡肽酶(prolyl oligopeptidase，POP)是一种81kDa的单体丝氨酸蛋白酶[1]，是丝氨酸蛋白酶S9家族的成员。POP在生物界中广泛存在，仅在酵母和放线菌中未检测到POP活性[2]。人类POP基因由15个外显子组成[2]。POP在哺乳动物的大脑中高度表达，主要存在于丘脑和皮质的GABA能和胆碱能中间神经元中[3]。此外，POP在睾丸，卵巢，肝脏和心脏也有大量表达。在生殖与发育方面，人类的初级精母细胞和精子细胞的细胞核中存在大量POP，卵母细胞和初级卵泡也有POP的表达[4]，我们前期报道POP表达于小鼠卵巢壁层颗粒细胞、卵丘细胞和黄体细胞[5-6]。POP主要通过切割脯氨酸残基的α-羰基发挥生物学效应[7]。结构研究表明，POP由30 kDa肽酶结构域组成，该结构域含有Ser-His-Asp催化三联体，顶部是40 kDa七叶β-螺旋桨结构域，能够限制底物进入大活性部位腔，实验和计算研究表明，为了调节底物进入POP的活性位点，这个结构域会发生大规模的构象变化[8]。新近研究发现，POP的非酶学活性也发挥重要的生物学效应。肝脏中的POP通过调节功能性线粒体蛋白和核酸结合蛋白来影响代谢[9]。在肝星状细胞中，POP通过诱导Smad 7和PPAR-γ减少TGF-β超家族成员的信号传导，表明POP对肝纤维化的保护作用[10]。
1 POP的功能 1.1 POP的酶学功能POP作为丝氨酸蛋白酶S9家族中的一员，水解底物一般具有Y-Pro-X结构，X表示除脯氨酸外的氨基酸，Y表示保留的残基或多肽。POP还可以特异性地水解脯氨酸之外的氨基酸如丙氨酸、丝氨酸、α-氨基、羟脯氨酸和半胱氨酸。POP的水解效率依次为Pro>Ala>Cys>Ser[2]。研究表明其参与了多种肽激素和神经肽的成熟和降解，例如促甲状腺素释放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)、血管紧张素(angiotensin，Ang)、精氨酸加压素(arginine-vasopressin，AVP)、α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)、促黄体激素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone，LHRH)、物质P (substance P，SP)和神经降压素(neurotensin，NT)等[3]。POP是脑脊液中SP降解的主要水解酶。它通过切割P物质肽链中Pro4-Gln5之间的肽键，从而发挥其水解作用[11]。已知TRH的降解需要四种酶的参与，分别是焦谷氨酰氨肽酶Ⅰ(PAP Ⅰ)、焦谷氨酰氨肽酶Ⅱ(PAP Ⅱ)、甲状腺激素酶和POP，POP可以使TRH或PAP Ⅰ/PAP Ⅱ/甲状腺激酶的产物His-Pro-NH2脱酰胺进而发挥水解作用。此外，POP可以通过切割NT分子中的Pro7-Arg8和Pro10-Tyr11之间的肽键促使NT降解[11]。POP在血管生成素Ⅰ和血管生成素Ⅱ生成血管紧张素(1-7)的过程中也发挥重要的水解作用[12]。POP还参与胸腺素-β4的降解，当体内的POP被抑制时，胸腺素-β4(ThyMosinβ4，Tβ4)的降解产物Ac-SDKP减少[13]。Tβ4-POP-Ac-SDKP轴在促进组织愈合和疤痕形成中起重要作用[8, 13]。POP的水解活性与底物的磷酸化状态有关，研究表明，如果POP底物丝氨酸的P10残基发生了磷酸化，反应速率可以提高；而如果丝氨酸未发生磷酸化，POP甚至不能切割Ala-Ser之间的肽键[11]。
1.2 POP的非酶学功能新近研究表明，POP不仅通过酶学活性发挥重要的生物学作用，还表现出非酶学的活性。POP可以负调控IP5/6的多肌醇聚磷酸酶(MInsPP)的生成来控制IP3的合成[13]。在帕金森病患者的大脑中，POP可以与α-突触核蛋白(Synuclein α, αSyn)结合并能加速αSyn的聚集[14]。同时，POP也是PI3K类自噬通路的负调控因子，抑制自噬小体的形成，能减弱自噬小体对αSyn的清除作用[15-16]，因此，POP对αSyn的聚集有双重作用。多巴胺转运蛋白(dopamine transporter，DAT)负责多巴胺再循环，DAT的功能由几种不同的机制调节，但DAT内化的主要调节因子是蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)介导的磷酸化，POP通过影响DAT的磷酸化改变其功能[14]。在胰腺癌细胞中，POP通过抑制TRS1的降解来增强P13K/AKT通路活性。在SH-SY5Y细胞系中，POP抑制剂不影响IP3信号传导，但可以降低p-ERK水平。ERK1 / 2属于MAPK家族，参与多种细胞过程，如细胞增殖和分化[6]。我们新近报道了POP通过激活ERK信号通路促进了小鼠黄体细胞孕酮的分泌[6]。
2 POP异常与疾病 2.1 帕金森病帕金森病(parkinson's disease，PD)是一种神经退行性运动障碍，涉及多种神经系统，其特征是黑质(substantia nigra，SN)中的多巴胺能神经元丢失，之后形成路易体(Lewy bodies，LBs)。LBs是PD的神经病理学标志。PD和其他突触核蛋白病的发病机制主要是αSyn的清除明显减少和αSyn的错误折叠及聚集，αSyn异常能破坏神经元的功能并最终导致细胞死亡[15]。POP不仅具有水解作用，还可以通过蛋白质-蛋白质相互作用发挥作用。在生理条件下，αSyn主要存在于神经末梢突触前的突触小泡周围，与许多促进其聚集的突触体蛋白结合。POP可以加速αSyn聚集过程，而POP的小分子抑制剂一方面可以减少αSyn寡聚体的形成，另一方面通过自噬作用增加αSyn寡聚体清除作用。自噬是真核细胞中广泛存在的一种利用溶酶体降解细胞内异常蛋白和受损细胞器的代谢过程，对维持细胞稳态起重要作用[17]。因此，POP抑制剂也通过双重作用抑制αSyn聚集，一方面通过阻断POP介导的途径，另一方面通过诱导自噬通量增加[15]。
2.2 肿瘤研究表明POP在许多癌症中的表达都会升高，而且在恶性肿瘤中的表达亦高于良性肿瘤，有文献报道卵巢上皮癌的恶性程度与POP含量呈正相关[4]。已知，POP参与血管形成，在恶性肿瘤中，POP通常与Tβ4一起过表达，Tβ4可被POP水解，进而产生血管生成肽Ac-SDKP，促进血管生成[18]。POP抑制剂可以抑制人神经母细胞瘤细胞系NB-1和人胃癌细胞系KATO的生长。POP抑制剂SUAM-14746与细胞周期G0/G1阻滞、细胞核内p27kip1水平升高以及pRb2/p130蛋白表达增加有关。已知POP是细胞周期循坏的正调节因子，它介导KATO Ⅲ细胞调节细胞周期的退出或重新进入细胞周期。POP抑制剂不仅阻止细胞周期的G0/G1期，而且还阻碍S期和G2期及M期的进展[19]。除此之外，有体外研究表明抑制POP蛋白酶水解活性可阻止胃癌细胞的生长[18]。POP抑制剂SUAM-14746以抑制细胞增殖的方式抑制乳腺癌细胞的生长，因此，POP还是用于乳腺癌治疗的潜在靶向分子[20]。
3 POP抑制剂潜在的治疗前景研究表明POP参与了广泛的生理和病理过程，因此POP抑制剂可能成为靶向药物。POP抑制剂可分为化学合成抑制剂和天然抑制剂。合成抑制剂又可分为拟肽、杂芳基酮，主要有KYP-2047、JTP-4819、ZPP等；天然抑制剂大多是生物碱，主要有黄芩素、小檗碱等[3, 21]。
3.1 JTP-4819JTP-4819，化学名为左旋-(2S)-苄胺碳酰基-[(2S)-2-乙醇酰吡咯烷基]-2-吡咯烷甲酰胺，是一种竞争性可逆抑制剂，具有高度特异性，不会抑制其他脯氨酸特异性酶[3]。JTP-4819可以抑制神经肽的降解，如TRH、AVP和SP，从而增加认知功能[3, 22]，因此被称为认知增强剂。有文献报道JTP-4819可以治疗东莨菪碱诱导的遗忘症，进一步的研究表明发挥作用的机制是JTP-4819抑制了POP的水解作用，使大脑中的SP和AVP增加，导致胆碱能释放增加[21]。在阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)动物模型中，JTP-4819改善了大鼠背侧海马区病变的空间学习障碍[22]。JTP-4819对神经肽能和胆碱能神经元的作用，以及对动物记忆障碍的改善，使它成为AD治疗的一个方向[3]。在药物性质方面，JTP-4819可以透过血脑屏障，在脑和组织中的药物浓度几乎相同。然而，实验发现由于JTP-4819的高度亲水性，使它很难通过神经元细胞膜，这将降低它在治疗神经障碍中的作用[3]。
3.2 KYP-2047KYP-2047，化学名为(2S)-1-[[(2S)-1-(1-氧代-4-苯基丁基)-2-吡咯烷基]羰基]-2-吡咯烷腈，是JTP-4819的衍生物，具有特异性和良好的选择性[3]。KYP-2047比JTP-4819有更强的透过性，能高效透过血脑屏障并且效果持久，它能均匀地分布在皮质，海马和纹状体中。相同剂量下，KYP-2047能比JTP-4819更快到达细胞内作用位点。已知POP促进αSyn的错误折叠和聚集，KYP-2047不仅可以通过水解POP减弱POP和αSyn之间的共定位阻止αSyn的堆积[14]，还可以上调自噬的正调控因子beclin 1，促进αSyn聚集体的降解[16]。POP抑制剂KYP-2047对突触核蛋白及其聚集的显著影响可能为PD的药物治疗开辟新途径。此外，POP参与Ac-SDKP的产生，KYP-2047还能通过抑制Ac-SDKP的生成进而影响新血管的形成[3]。
3.3 ZPPZPP，化学名为N-苄氧酰基羰-脯氨酰-脯氨酸，是人们发现的第一种有效的POP特异性抑制剂[3]。ZPP是一种竞争性抑制剂，IC50=0.74 nmol·L-1，它与POP结合后不仅能在空间上阻断POP活性位点的疏水性头部，而且与催化结构域的SER554残基形成可逆的共价半缩醛键[23]，干扰POP的作用。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是一种糖酵解蛋白，不仅可以产生能量，而且还是一种多功能酶[3]。在特定情况下，GAPDH经凋亡因子诱导后会过表达，继而转移到细胞核中，最后引起细胞死亡。ZPP可以通过阻止GAPDH易位至细胞核中发挥作用。已知GAPDH可以和某些神经变性疾病的蛋白质结合，如AD中的β-淀粉样蛋白前体蛋白和亨廷顿病(Huntington's disease，HD)中的聚谷氨酰胺重复序列[3]。因此，ZPP也可能成为神经相关性疾病的治疗药物目标。
3.4 小檗碱将天然产品用于医疗方面在国际上越来越受欢迎，药用植物是药物研究和开发的重点对象，因为它们能产生具有各种各样生物活性的化学分子。小檗碱是一种异喹啉生物碱，可以从许多药用植物中分离。它是POP的非共价抑制剂，IC50=145 μmol·L-1。小檗碱作为一种天然药品有很多优点，如易溶于水，毒性小，易通过血脑屏障到达中枢神经系统。Aβ是AD病理生理学中最重要的标志之一，β-淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1是生成Aβ过程中的限速酶，小檗碱可以下调β-淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1[3]，这表明小檗碱可能成为AD治疗的靶标。研究表明，小檗碱类似物有更好的抑制效果。由于小檗碱是一种天然化合物，所以它为治疗神经精神疾病开辟了新的视角[4, 12]。小檗碱还具有多种药理作用，对心血管疾病、糖尿病、高脂血症、癌症、腹泻和阿尔茨海默病等疾病都有治疗作用[24]。
3.5 黄芩素黄芩素(5，6，7-三羟基黄酮)是从黄芩中分离出的主要类黄酮，可以到达中枢神经系统，具有一定的剂量依赖性[25]。由于黄芩苷是黄芩素的前药，所以这两种化合物都能够特异性抑制POP。黄芩苷及其糖苷配基衍生物黄芩素的IC50相似，表明糖部分不参与黄芩苷与POP的相互作用。通过对体外胃肠道和血脑屏障吸收途径的研究发现黄芩素才是实际到达中枢神经系统发挥作用的分子，因此，黄芩苷是一种能够抑制POP的新型前药[25]。黄芩素可以影响多因素神经退行性疾病，如AD和PD。在AD中，黄芩素不仅可以预防Aβ-肽的纤维形成和寡聚化，还能够解聚已形成的纤维蛋白。在PD中，黄芩素具有抑制αSyn聚集的能力，在神经传递，膜转运系统和突触维持中发挥重要作用[3]。
4 结语POP与多种神经退行性疾病有关，但是除了αSyn，POP对其他神经性疾病的作用机制尚未研究清楚。POP在肿瘤的发生中也起重要作用，使POP抑制剂成为研究的热点。POP抑制剂种类虽多，但不同抑制剂发挥作用的位点及抑制效果有很大差异。关于POP在生理和病理中的作用以及POP抑制剂的开发需要进一步的探索。
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