2. 延边大学医学部细胞功能研究中心, 生理学与病理生理学教研室, 吉林 延吉 133000
2. Cellular Function Research Center, Dept of Physiology and Pathophysiology, College of Medicine, Yanji, Jilin 133000, China
依托咪酯(etomidate，ET)是一种作用强、短效的非巴比妥类静脉麻醉药，在临床中被广泛使用。前期在体电生理学和神经药理学手段研究发现，ET降低在体小脑皮层浦肯野细胞的单纯峰电位放电频率并具有浓度依赖性，ET(300 μM)完全抑制自发性单纯性放电，但自发性复杂峰电位放电依然存在。ET(300 μM)不仅完全抑制自发性单纯性放电，而且抑制自发性复杂峰电位放电小穗数量[1]。另有研究报道，ET通过激活GABAA和甘氨酸受体来抑制在体小鼠小脑浦肯野细胞(Purkinje cell，PC)活性[2]，而目前为止ET影响在体动物小脑皮质分子层感觉信息处理的机制尚不清楚。因此，我们有必要深入研究ET对乌拉坦麻醉小鼠小脑分子层中感觉刺激诱发反应的影响，为探讨ET对小脑皮层功能的影响机制做好前期准备。
1 材料 1.1 实验动物健康♂或♀ HA/ICR小鼠，购自延边大学实验动物中心，许可证编号：SYXK (Ji) 2011-006。在光照周期(12 h :12 h)中，自由获取食物和水。
1.2 仪器美国产Axopatch-200B膜片钳放大器、1440AD/DA转换器、膜片钳专用显微镜(Nikon Eclipse E-600FN, Japan)、体视显微镜(Nikon, 日本)、Clampex10.3数据采集与分析软件及美国Sutter公司生产的MP-385电动微操纵器等。
1.3 药物与试剂ET(批号：20140812)、SR95531、士的宁，购自Sigma-Aldrich(中国上海)。将所有化学品溶解形成溶液并保持冷冻成等分试样, 最后在含氧的人工脑脊液中以0.4ml/min的速度将它们灌流于小脑表面。
2 方法 2.1 动物模型的制备参照参考文献[3]的模型制备方法，经腹腔注射乌拉坦1.3 g·kg-1施行麻醉，并植入自制气管导管妥善固定，然后将小鼠置于特制的脑立体定位仪上，用双侧耳棒固定头部，在小脑CrusⅡ小叶进行开颅手术，开孔直径约为1~1.5mm，将小鼠和脑立体定位仪同时固定在显微镜下，确定需要记录的部位后进行电生理记录。
2.2 分子层场电位记录参照参考文献[4]的场电位记录方法，使用Multi-clamp700B放大器，通过D/A转换器1440和Clampfit10.3软件获取感觉刺激活动数据。
2.3 统计分析电生理学数据分析采用Clampfit 10.3软件(Molecular Devices, Foster City, California, USA)，所有数据采用x±s表示，并应用SPSS软件(Chicago, Illinois, USA)进行配对T检验。
3 结果 3.1 ET对感觉刺激诱发小脑皮层分子层场电位的影响吹风刺激(30 ms，60 psi)同侧触须垫诱发分子层产生正相波(P1)和负相波(N1)。小脑表面灌流ET(50 μmol·L-1，10 min)明显抑制P1反应，导致振幅减少(P＜0.05)。ET对P1振幅的抑制作用具有明显的浓度依赖性，最低有效浓度为10 μmol·L-1，半数抑制浓度为64.57μmol·L-1，ET浓度为500μmol·L-1时，下降至基线的98.68%。
3.2 ET对感觉刺激诱发的P1动态特性的影响小脑表面灌流ET50 μmol·L-1，P1的半宽增加(P＜0.05), P1曲线下面积明显较小(P＜0.05)，另外，ET明显增加了P1的上升时间和衰减时间(P＜0.05)。
3.3 ET对GABAA受体或甘氨酸受体被阻断时感觉刺激诱发反应的影响小脑表面灌注GABAA受体拮抗剂SR95531(gabazine，20 μmol·L-1)阻断感觉刺激诱发的GABA能反应P1，并显示刺激诱发的兴奋性反应N2。在SR95531的存在下，依托咪酯对N2的振幅没有明显影响(P＞0.05)，N2的波形下面积与单独给予gabazine时的波形下面积差异无显著性(P＞0.05)。这些结果表明ET通过GABAA受体调节感觉刺激诱发小脑皮层分子层场电位反应。此外，在甘氨酸受体拮抗剂士的宁(strychnine，10 μmol·L-1)存在的情况下，感觉刺激对P1振幅没有明显影响(P＞0.05)，再灌流ET(50 μmol·L-1，10 min)，P1振幅明显下降(P＜0.05)，这与单独给予ET相似。这些结果表明，甘氨酸受体阻断剂无法阻断依托咪酯诱导的面部刺激诱发的抑制反应。
3.4 ET通过小脑皮层MLI抑制感觉刺激诱发的反应ET(50μmol·L-1，)给药10 min明显抑制自发性峰电位和触觉诱发峰电位，自发性、感觉诱发锋电位的标准化数量[(1.64±1.6)%、(21.0±6.4)%]较基线[(100.0±1.35)%、(102.0±10.07)%]降低(P＜0.05)。这些数据表明小脑表面灌注依托咪酯会抑制小脑MLI中的自发性和感觉诱发的峰电位活动，导致分子层对感觉诱发抑制效应的减弱。
4 讨论依托咪酯可直接或间接作用于GABAA受体，产生GABA样的作用，或增强GABA与GABAA受体结合所引起的效应，减少神经元动作电位的发生频率[5]。依托咪酯显著抑制初级感觉皮层锥体细胞电压门控性Na+离子通道，减小Na+电流，提示依托咪酯可能通过抑制初级感觉皮层神经元Na+离子通道，降低神经元兴奋性，影响感觉信息的整合[6]。另有研究报道，依托咪酯可抑制大鼠海马CA1区兴奋性突触传递，机制可能与增强突触前GABA能性抑制性回路的兴奋性有关[7]。
那么，ET如何影响小脑皮层功能的呢？ET对小脑皮层PC影响的受体机制已有报道[2]，如引言中所述，ET通过激活GABAA和甘氨酸受体来抑制在体小鼠小脑PC活性。而我们研究结果显示，依托咪酯明显抑制小脑分子层中感觉刺激引起的GABA能反应的振幅，表明它可调节GABA能的突触传递。依托咪酯诱导的感觉诱发GABA能振幅的减少可能是由于依托咪酯通过激活GABAA受体来抑制MLIs介导的感觉诱发反应，通过MLI响应刺激可导致GABA释放减少。另一方面，依托咪酯诱导的GABA能上升和衰减时间的延长，表明依托咪酯抑制MLI-PC突触内的GABAA受体活性。实际上，通过阻断GABAA受体活性，依托咪酯未能增强小鼠小脑皮层平行纤维到浦肯野细胞的兴奋性输入，证实依托咪酯通过调节GABAA受体调节小脑皮层分子层感觉信息处理。我们未来将进一步研究ET对小脑皮层颗粒细胞层的影响，为进一步探讨ET麻醉作用的细胞与分子机制奠定坚实的理论基础。
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