2. 福建中医药大学中西医结合学院, 福建 福州 350122;
3. 福建中医药大学康复医学院, 福建 福州 350122
2. Integrative Medicine College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;
3. Dept of Rehabilitation Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China
随着生活节奏的加快和社会竞争的加剧，人们的心理压力逐渐加大，抑郁症患病人数逐年增加，困扰了人们的生活[1]。抗抑郁药特别是治疗快速、疗效好、安全性高的抗抑郁药逐渐成了社会上新的研究话题。传统的抗抑郁药除了对肝脏、神经系统会的损害，还有报道表明各类抗抑郁药如五羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)、单胺氧化酶抑制剂(monoamine oxidase inhibitors，MAOIs)和去甲肾上腺素(NA)再摄取抑制剂(serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors，SNRIs)以及一些新型的抗抑郁药都会不同程度地造成性功能障碍[2-3]。许多临床研究也报道了抗抑郁药导致性功能障碍的不良反应，尤其是服用含有五羟色胺能特性的抗抑郁药患者出现性功能障碍的可能性更大。而SSRIs是目前临床较常用的一类抗抑郁药，它所引起的性功能障碍也是其比较公认的不良反应[4]。目前，氟西汀已作为动物实验中雄性大鼠性功能障碍的造模药物。有临床研究证实，SSRIs类抗抑郁药引起性功能障碍的不良反应的原因不仅有中枢作用，还有外周作用[5]。而其具体作用机制还不是非常清楚。
由于西药抗抑郁药不良反应较多，人们开始从传统的植物或药方中寻找有效治疗抑郁的植物或药物[6]。中医药是我国从古至今的瑰宝，在治疗抑郁方面有着丰富的经验，且相比于西药抗抑郁药，有着较少的不良反应。蒲郁胶囊是由五味子、酸枣仁、柴胡、郁金、牡蛎等11味药物组成的中成药，临床上常用于治疗抑郁症、神经衰弱、焦虑症及更年期综合征等，疗效显著。课题组前期研究也证实蒲郁胶囊在小鼠强迫游泳、悬尾和慢性应激抑郁模型上具有明显的抗抑郁作用(发表中)，并且在利血平诱导的抑郁模型、育亨宾毒性实验中显示出明显的作用(说明药物可以增强NA的作用)，对小鼠5-HT增强实验结果无影响，初步认为其抗抑郁机制与5-HT无关[7]，但其具体作用靶点和副作用仍然不明。本实验采用交配行为实验和非接触性阴茎勃起实验评价蒲郁胶囊对雄性大鼠性功能的影响，并与米氮平和SSRIs类抗抑郁药氟西汀进行比较，同时加入5-HT1A受体拮抗剂WAY100635和5-HT1A受体部分激动剂丁螺环酮，观察其对大鼠性功能的影响是否与5-HT有关，旨在发掘蒲郁胶囊的抗抑郁的作用特点和和机制。
1 材料 1.1 动物SPF级Wistar大鼠，♂和♀各60只，体质量(150±20)g。统一采购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。
1.2 药品蒲郁胶囊(四川诺迪康威光制药有限公司，溶剂：蒸馏水，0.47 g/粒，批号：150705)；氟西汀(常州第四制药厂，溶剂：蒸馏水，20 mg/片，批号：201511162)；米氮平(华裕(无锡)制药有限公司，溶剂：蒸馏水，30 mg/片，批号：16110105)；苯甲酸雌二醇(宁波第二激素厂，溶剂：花生油，2 g·L-1，批号：161210)；黄体酮(浙江仙琚制药股份有限公司，溶剂：花生油，批号：160205，20 g·L-1)；WAY100635(CAS Number: 634908-75-1，Sigma-Aldrich)；丁螺环酮(CAS Number：33386-08-2，Sigma-Aldrich)大鼠雄激素试剂盒(上海西唐生物科技有限公司，批号：1703263)。
1.3 仪器超低温冰箱(美国Eppendorf公司)、微型冷冻离心机(美国Eppendorf公司)、大鼠透明观察笼(PC-R4)(中国丰硕动物实验器材)、金属丝笼(自制)、连续波长多功能酶标仪(奥地利TECAN公司)、微量震荡仪(东南科仪有限公司)。
2 方法 2.1 ♀发情大鼠的制备 2.1.1 卵巢摘除术将♀大鼠用300 mg·kg-1水合氯醛麻醉后固定，在大鼠最末肋骨下(离尾椎约7~8 cm距离)，沿中线和距脊柱外侧去皮毛，碘伏局部消毒，自腰椎沿背部正中线向下，切开皮肤，于左右两肋剪开腰肌。分离脂肪，可见位于两侧肾脏外下方呈粉红色的卵巢，结扎卵巢下输卵管及脂肪，剪下卵巢，确定无出血后，将子宫角送回腹腔，缝合，伤口涂碘伏, 如Fig 1。术后连续3日每只雌鼠每日肌注青霉素4万U，术后休息两周。将60只摘除卵巢的大鼠，随机分为12笼饲养，每笼5只。每天均正常喂养食物和水。
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| Fig 1 Preparation of female estrus rats |
每只雌鼠测试52 h之前皮下注射0.002 mg·L-1苯甲酸雌二醇30 μg，4~6 h前皮下注射0.01 mg·L-1黄体酮500 μg，促进雌鼠发情，苯甲酸雌二醇和黄体酮注射液用玉米油稀释水浴加热1 h混匀后备用。
2.2 ♂大鼠筛选和给药程序 2.2.1 ♂大鼠的筛选参照文献并稍做修改，实验于下午4 :00开始进行，室内环境为安静，暗光观察，将雄鼠放入40 cm×60 cm×40 cm大鼠透明观察笼中适应5 min后再放入发情雌鼠，观察交配行为，30 min/次，在30 min内如果出现1次插入行为即可停止实验，一周2~3次，进行4次训练，♂大鼠在后3次(或共3次)均有插入行为的大鼠入选。
2.2.2 给药程序正常喂养4周后，将♂大鼠按体质量随机分为6组，分别为空白对照组(Control，Con)，氟西汀10 mg·kg-1组(Fluoxetine，Flx)，米氮平2 mg·kg-1组(Mirtazapine，Mirta)，蒲郁胶囊(PuYu capsule)的235、470、940 mg·kg-1 3个剂量组(分别是临床等效剂量的0.5、1、2倍，参考药理学实验教材中的换算公式进行换算得出)，各组溶剂均用蒸馏水稀释。灌胃给药时间为每天早晨9点，每天1次，连续给药23 d，在d 6和d 13进行交配行为实验，d 7和d 14进行非接触性阴茎勃起实验，在d 19、20和d 23、24急性给予5-HT1A受体拮抗剂WAY100635(0.3 mg·kg-1, 腹腔注射)[8]和5-HT1A受体部分激动剂丁螺环酮(buspirone，15 mg·kg-1, 腹腔注射)[9]拮抗剂后观察交配行为实验和非接触性阴茎勃起实验。继续重复给予氟西汀、米氮平和蒲郁胶囊1周后，处死大鼠，取材备用。如Fig 2。
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| Fig 2 Procedure of drug administration |
实验于下午4 :00开始进行，室内环境为安静，暗光观察, 将雄鼠放入40 cm×60 cm×40 cm大鼠透明观察笼中适应5 min后再放入发情雌鼠，观察交配行为，30 min/次，测试指标如下，1)爬垮次数Nm(number of mounts); 2)射精次数Ne(number of ejaculations，射精指标：插入后停留1~3 s，规律的收缩，之后雌鼠离开雄鼠，雄鼠舔舐生殖器); 3)爬垮潜伏期Ml(mount latency，从放入雌鼠到第1次扑捉的时间); 4)射精间歇时间Pi(post ejaculatory interval，从射精到下一次交配的时间); 5)插入次数Ni(number of intromissions，事后舔舐生殖器); 6)插入潜伏期Il(intromission latency，从放入雌鼠到第一次插入的时间)。
2.4 非接触性阴茎勃起实验[10]实验于下午4 :00开始，将发情雌鼠提前30 min单独放于金属丝笼(40 cm×25 cm×18 cm)中，将雄鼠单独放于另一金属丝笼(40 cm×25 cm×18 cm)中，紧贴雌鼠笼适应5 min后，观察30 min。室内环境为安静暗光，记录雄鼠阴茎勃起次数Pe(penile erections)。
2.5 取材实验于早上9点开始，将雄鼠断头取血，取出的血液用离心机将血清和血浆分离，将血清吸出放于新的EP管中，转移至-80 ℃冰箱备用。
2.6 ELISA法检测♂大鼠血清雄激素水平① 取空白组、米氮平组、氟西汀组、蒲郁胶囊高、中、低组血清做100倍稀释(1 μL血清，加标本稀释液99 μL，稀释100倍)；②每孔加入标准品或待测样品100 μL于96孔酶标板上，混匀后恒温箱37 ℃ 40 min；③洗涤4~6次，滤纸上印干；④每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL(空白除外)，混匀后37 ℃ 20 min，再次洗板；⑤每孔加酶标抗体工作液100 μL，置37 ℃ 10 min，再次洗板；⑥每孔加入底物工作液100 μL，37 ℃暗处15 min；⑦每孔加入100 μL终止液混匀，于30 min内在450 nm处用酶标仪检测吸光值。
2.7 统计学分析本实验统计学分析采用GraphPad Prism 7.0统计软件，多组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA，post hoc test选用Dunnett’t检验)。
3 结果 3.1 蒲郁胶囊重复灌胃给药(d 6)对♂大鼠交配行为的影响在交配实验中，与对照组比较，氟西汀(10 mg·kg-1)灌胃给药6 d延长雄鼠Ml、Il和Pi，并且Nm、Ni和Ne表现出明显缩短的趋势，而蒲郁胶囊(235~940 mg·kg-1)和米氮平(2 mg·kg-1)对♂大鼠交配行为均无影响(见Fig 3)。
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| Fig 3 Effects of administration (d 6) of PuYu capsule on mating behavior of male rats (x±s, n=10) A:Ml, Il, Pi; B:Nm, Ni, Ne. **P < 0.01 vs control |
♂大鼠灌胃给药13 d后，与空白组比较，氟西汀组大鼠不仅延长Ml、Il和Pi，而且减少Nm、Ni和Ne。而蒲郁胶囊和米氮平对♂大鼠交配行为均无影响。见Fig 4。
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| Fig 4 Effects of administration (d 13) of PuYu capsule on mating behavior of male rats (x±s, n=10) A:Ml, Il, Pi; B:Nm, Ni, Ne. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
♂大鼠灌胃给药7 d后，与空白组比较，氟西汀会减少♂大鼠非接触性Pe，蒲郁胶囊和米氮平对大鼠Pe改变没有显著性差异。灌胃给药14 d后，与空白组比较，氟西汀会减少♂大鼠非接触性阴茎勃起次数，蒲郁胶囊和米氮平对其Pe没有显著性差异(见Fig 5)。
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| Fig 5 Effects of administration (d 7, d 14) of PuYu capsule on penile erections of male rats(x±s, n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
♂大鼠灌胃给药19 d后，急性给予WAY100635，与对照组比较，氟西汀、米氮平、蒲郁胶囊对雄鼠Ml、Il、Pi、Nm、Ni、Ne均无影响，提示WAY100635可以逆转氟西汀引起的性功能障碍, 同时对蒲郁胶囊无影响(见Fig 6)。
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| Fig 6 Effects of administration (d 19) of PuYu capsule and WAY100635 on mating behavior of male rats (x±s, n=10) A:Ml, Il, Pi; B:Nm, Ni, Ne. |
♂大鼠灌胃给药23 d后，急性给予丁螺环酮，与对照组比较，氟西汀、米氮平、蒲郁胶囊对雄鼠Ml、Il、Pi、Nm、Ni、Ne均无影响，提示丁螺环酮可以逆转氟西汀引起的性功能障碍，同时对蒲郁胶囊无影响(见Fig 7)。
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| Fig 7 Effects of administration (d 23) with PuYu capsule and buspirone on mating behavior of male rats (x±s, n=10) A:Ml, Il, Pi; B:Nm, Ni, Ne |
♂大鼠灌胃给药20 d和24 d后，急性给予WAY100635和丁螺环酮，与对照组比较，氟西汀、米氮平、蒲郁胶囊对雄鼠勃起次数均无影响(见Fig 8)。
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| Fig 8 Effects of 20 d or 24 d administration with PuYu capsule and WAY100635 or buspirone on penile erections of male rats (x±s, n=10) |
如Tab 1所示，取雄鼠血清做试剂盒后，与空白组比较，氟西汀、米氮平和蒲郁胶囊组都没有明显变化。
| Group | n | Dose/mg·kg-1 | Androgen |
| Control | 9 | - | 27.31±5.26 |
| Fluoxetine | 10 | 10 | 28.82±6.54 |
| Mirtazapine | 9 | 2 | 28.16±6.72 |
| PuYu capsule low dose | 10 | 235 | 36.72±6.16 |
| PuYu capsule middle dose | 10 | 470 | 32.03±6.45 |
| PuYu capsule high dose | 10 | 940 | 31.90±8.97 |
由于SSIRs类抗抑郁药对性功能的影响，越来越多学者开始关注抗抑郁药引起性功能障碍的原因，Hueletl-Soto等[10]在大鼠实验中证实了慢性给予氟西汀对大鼠造成的性功能障碍，而Sukoff Rizzo等[8]通过动物实验发现5-HT1A受体阻断药可逆转氟西汀引起的性功能障碍。Schijven等[11]发现五羟色胺能系统异常的弗林德敏感系(FSL)大鼠与弗林德抗性株系(FRL)大鼠相比射精率更高，可能是由于FSL大鼠5-HT1A受体密度较低的缘故，进一步推测引起性功能障碍的主要作用靶点可能是突触后膜的5-HT1A受体。
本实验采用大鼠交配行为实验和非接触性阴茎勃起实验来检测药物对♂大鼠性功能的影响。首先重复给予蒲郁胶囊、氟西汀和米氮平1周和2周后分别观察大鼠性功能的变化，发现氟西汀重复给药1周即可导致大鼠性功能障碍，蒲郁胶囊和米氮平无此不良反应；重复给药2周后，结果与1周的结果一致。说明氟西汀重复给药能引起大鼠性功能障碍，与其他研究结果一致，同时可以证实蒲郁胶囊重复给药对大鼠性功能无影响。
为了进一步验证性功能障碍的发生机制与5-HT的关系，在重复给药后分别急性给予5-HT1A受体拮抗剂WAY100635和部分激动剂(部分激动剂的特点为单用有较弱的激动作用，与激动药合用时为拮抗作用)丁螺环酮可以逆转氟西汀的性功能障碍作用，这与其临床疗效是一致的。同时WAY100635和丁螺环酮对蒲郁胶囊无影响，说明氟西汀引起性功能障碍的可能靶点在5-HT1A受体，而蒲郁胶囊的抗抑郁作用与5-HT1A受体无关。
在选择氟西汀的同时，我们还选择了米氮平作为对照药物，米氮平[12]被分类为去甲肾上腺素和特异性5-羟色胺能抗抑郁药，作为肾上腺素α2受体的拮抗剂，其功能主要是抑制自受体和异受体，提高去甲肾上腺素和5-羟色胺能的神经传递，但是并没有性功能障碍的副作用[13]。有研究认为，米氮平的突触后5-HT拮抗作用与其突触前α2-肾上腺素受体阻断相结合是逆转SSRIs诱导的性功能障碍的作用机制[14]。米氮平不具有5-羟色胺能活性，不会引起5-羟色胺能副作用或5-羟色胺综合征，这与其不是5-羟色胺再摄取抑制剂或单胺氧化酶抑制剂，也不是5-羟色胺受体激动剂的事实一致。在米氮平的临床研究中发现它可以上调重度抑郁症患者前额皮层的5-HT2A受体的表达[15]。以上研究都说明米氮平的抗抑郁作用与5-HT1A受体无关。进一步证实抗抑郁药引起的性功能障碍可能与5-HT1A受体有关。但米氮平会导致嗜睡、过度镇静、口干、食欲和体重增加等不良反应，严重影响患者的正常生活，并不是一个理想的抗抑郁药物。
因为测试对象为♂大鼠，我们在行为学结束后继续给药1周后取血，通过大鼠雄激素试剂盒检测受试雄鼠的性行为变化是否与雄激素的变化有关，结果显示蒲郁胶囊、氟西汀和米氮平对雄激素没有影响，说明氟西汀对性功能的影响不是通过影响雄激素而引起的。
本实验研究对象蒲郁胶囊的主要成分郁金，味苦，性寒，具有解郁、凉血之功；石昌蒲，味苦，性温，具有开窍、豁痰之力，再配以具有柴胡等疏肝解郁的10余种中药，从而有疏肝解郁、清心化痰的功效。临床应用上，蒲郁胶囊对抑郁症有良好的治疗作用，且不良反应较少。本课题的前期研究也表明蒲郁胶囊在悬尾、强迫游泳抑郁小鼠模型和慢性不可预知抑郁小鼠模型上都有明显的抗抑郁作用。通过本实验的研究可以看出蒲郁胶囊对性功能的影响优于氟西汀等五羟色胺再摄取抑制剂，体现了中药治疗抑郁症的临床优势；同时，在前期机制研究中发现蒲郁胶囊对5-HT作用不敏感，与本实验结果一致，提示蒲郁胶囊的抗抑郁机制与5-HT无关，其具体作用靶点还需进一步研究证实。
总之，抗抑郁西药如氟西汀等在治疗抑郁症时，虽然疗效明显，但其不良反应繁多，在治疗的同时又使患者承受其他痛苦，长期的服用还会对肠胃和肝脏造成一定的损害，并且不能预防抑郁症的复发。中医药治疗抑郁症有辨证施治、专方专药等诸多方法，但在诊断和疗效标准、证型规范等方面依旧存在问题，所以需要我们不断的对中药药理作用和机制进行深度研究和反复验证，为中药新药的开发奠定基础。
( 致谢: 本研究在福建中医药大学中药药理毒理实验室王玉露课题组完成，研究工作得到该实验室诸多同仁的帮助，特此致谢! )
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