2. 河北医科大学临床学院实验中心, 河北 石家庄 050017;
3. 河北医科大学基础医学院药理教研室, 教育部血管与神经生物学重点实验室, 河北 石家庄 050017
2. Experiment Center of Clinical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China;
3. Dept of Pharmacology, School of Basic Medical, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
在生理状态下，机体受到强烈的机械、化学及热刺激后，局部组织损伤，释放前列腺素E、组胺、羟色胺、缓激肽等致痛物质，兴奋伤害性感受器，产生异常动作电位，经由三叉神经节或背根神经节中的中小型神经元感受并向中枢传递, 引起疼痛反应。目前的镇痛药主要包括中枢性镇痛药和非中枢性抗炎药[1]，后者主要是非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，通过抑制花生四烯酸环氧化酶(cyclooxygenase，COX)的活性来抑制炎性介质的分泌而发挥作用，但存在消化道溃疡、肾脏毒性、血小板功能障碍等不良反应，以及镇痛效果较弱的特点。使用NSAIDs，用药剂量达到一定水平以上时，增加药物剂量既不能增强其镇痛作用，又明显增加药物的毒性反应。因此，临床上如果需要长期使用NSAIDs，或日用剂量已经达到限制性用量时，应考虑更换为阿片类镇痛药[2]，但阿片类药物由于其成瘾性等副作用限制了其临床应用。
通过联合用药可以增加主要药物的镇痛效果或减轻副作用，减少阿片类药物的应用。钾离子通道在维持神经细胞膜电位和兴奋性中起重要作用，多项研究表明[3]，电压门控性钾离子通道家族(voltage dependent potassium channel，Kv)中，Kv7通道开放剂可以通过提高电压依赖性钾电流[voltage dependent potassium currents，IK(M)]使膜静息电位处于超极化状态，降低神经元的兴奋性，阻断疼痛信号的产生和神经传导，具有良好的镇痛应用前景。
目前临床上应用的NSAIDs主要是阿司匹林(aspirin)，醋酸扭体法和热板法是最常见的筛选镇痛药的方法，因此，本课题组选用两种Kv7通道开放剂氟吡汀(flupirtine)、瑞替加滨(retigabine)，通过醋酸扭体法和热板法探究其是否能提高阿司匹林的镇痛作用，以期为新型镇痛药的开发以及不同类型镇痛药的联合应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 动物与试剂 1.1.1 实验动物清洁级健康小鼠，由河北医科大学实验动物中心提供。实验动物使用许可证号:SYXK(冀)2018-008。
1.1.2 试剂和仪器注射用精氨酸阿司匹林，瑞阳制药有限公司，批号：17083102；瑞替加滨，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%，批号：D17S6K3493；马来酸氟吡汀，上海源叶生物科技有限公司，纯度99%，批号：N03M9W60415；冰醋酸，天津市永大化学试剂有限公司，批号：20160625；生理盐水，石家庄四药有限公司，批号：1801203402；RCY-2热板测痛仪，石家庄市冀星实验仪器有限公司。
1.2 方法 1.2.1 扭体法清洁级小鼠42只(♂♀兼用)，体质量(20±2)g，随机分成6组，即对照组、阿司匹林组(600 mg·kg-1)、氟吡汀组(20 mg·kg-1)、瑞替加滨组(20 mg·kg-1)、阿司匹林(600 mg·kg-1)+氟吡汀(20 mg·kg-1)组、阿司匹林(600 mg·kg-1)+瑞替加滨(20 mg·kg-1)组，每组7只。分组腹腔注射给药，给药后30min，腹腔注射冰醋酸(1.2%，10ml·kg-1)，然后观察记录20min内各组扭体反应潜伏期及扭体反应次数。
1.2.2 热板法清洁级小鼠，♀，体质量(20±2)g，首先设定热板温度为(55 ±0.5)℃，选出痛阈在30s内的雌鼠供实验使用。将48只雌鼠随机分成6组，即对照组、阿司匹林组(600 mg·kg-1)、氟吡汀组(20 mg·kg-1)、瑞替加滨组(20 mg·kg-1)、阿司匹林(600 mg·kg-1)+氟吡汀(20 mg·kg-1)组、阿司匹林(600 mg·kg-1)+瑞替加滨(20 mg·kg-1)组。给药前先测定各小鼠给药前舔后足潜伏期时间，然后每组小鼠给予相应的药物, 给药15、30、45、60 min分别测定小鼠舔后足潜伏期时间1次。痛阈按60s计算，对60s不舔后足的小鼠，应立即取出。统计数据，计算不同时间舔后足潜伏期延长率。舔后足潜伏期延长率/%=(给药后各时间点测定的舔后足潜伏期-给药前舔后足潜伏期)/给药前舔后足潜伏期×100%。
1.3 统计学方法应用SPSS 17.0软件进行数据处理，所有数据以x±s表示，各组之间的比较采用双因素方差分析(two-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验。
2 结果 2.1 对醋酸所致小鼠扭体反应的影响与对照组相比，阿司匹林组扭体反应潜伏期时间明显延长(P＜0.01)，扭体次数明显减少(P＜0.01)；氟吡汀组、瑞替加滨组扭体反应潜伏期差异无显著性，但扭体次数明显减少(P＜0.01)；阿司匹林+氟吡汀组扭体反应潜伏期时间明显延长(P＜0.05)，扭体次数明显减少(P＜0.01)；阿司匹林+瑞替加滨组扭体反应潜伏期时间也明显延长(P＜0.01)，扭体次数也明显减少(P＜0.01)。
与阿司匹林组相比，阿司匹林+氟吡汀组扭体反应潜伏期无差异，但扭体次数明显减少(P＜0.01)；阿司匹林+瑞替加滨组扭体反应潜伏期明显延长(P＜0.01)，扭体反应次数明显减少(P＜0.01)。
氟吡汀组与瑞替加滨组在扭体反应中的镇痛作用未见明显差异，但与阿司匹林+氟吡汀组相比，阿司匹林+瑞替加滨组明显延长了扭体反应潜伏期时间(P＜0.01)。见Tab 1。
| Group | Latent period/min | Amount of turning body |
| Control | 4.60±1.14 | 36.86±3.15 |
| Aspirin | 9.09±0.44** | 20.00±0.82** |
| Flupirtine | 6.17±0.84 | 19.29±2.96** |
| Retigabine | 6.52±0.16 | 19.14±3.79** |
| Aspirin+Flupirtine | 8.14±1.13* | 9.71±2.24**## |
| Aspirin+Retigabine | 13.17±1.17**##△△ | 6.00±1.94**## |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs control; ##P＜0.01 vs aspirin; △△P＜0.01 vs aspirin+flupirtine | ||
与对照组相比，除瑞替加滨组外，各给药组在给药15 min后舔后足潜伏期延长率均明显增加(P＜0.05)；第30 min、45 min和60 min，除阿司匹林+瑞替加滨组与对照组相比舔后足潜伏期延长率明显增加外(P＜0.05或P＜0.01)，其余各组与对照组差异无显著性，但存在增加趋势。与阿司匹林组相比，除阿司匹林+氟吡汀组给药45 min舔后足潜伏期延长率下降外，阿司匹林+氟吡汀组和阿司匹林+瑞替加滨组在其余各时间舔后足潜伏期延长率均较阿司匹林组有增加趋势，其中阿司匹林+瑞替加滨组在30 min和60 min时与阿司匹林组差异有显著性(P＜0.05)。与阿司匹林+氟吡汀组相比，阿司匹林+瑞替加滨组在45 min和60 min舔后足潜伏期明显延长，舔后足潜伏期延长率差异有显著性(P＜0.01，P＜0.05)。见Tab 2。
| Group | Increment percentage of latent period/% | |||
| 15 min | 30 min | 45 min | 60 min | |
| Control | -26.37±4.53 | -19.56±8.25 | -4.23±10.23 | -16.13±19.78 |
| Aspirin | 3.12±12.36* | -5.26±18.66 | 24.51±30.54 | -7.07±20.52 |
| Flupirtine | 23.18±17.11* | -1.76±11.52 | 15.32±26.14 | 15.47±17.31 |
| Retigabine | -25.17±7.98 | -20.43±13.98 | -18.52±15.75 | 2.75±11.09 |
| Aspirin+Flupirtine | 6.68±10.96* | 18.29±15.86 | -5.58±8.33 | -3.96±6.86 |
| Aspirin+Retigabine | 25.69±17.19* | 73.33±22.83**# | 33.27±5.29△△ | 64.77±22.89*#△ |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs control; #P＜0.05 vs aspirin; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs aspirin+flupirtine | ||||
疼痛是临床常见的症状之一，目前临床上疼痛治疗的药物很多，阿司匹林是常用的药物之一。本文通过醋酸扭体法和热板法研究Kv7通道开放剂氟吡汀和瑞替加滨与阿司匹林的联合应用，为临床疼痛治疗和新型复方镇痛药物的开发提供一种新的方案。
阿司匹林是常用的NSAIDs，通过抑制体内前列腺素的生物合成，降低前列腺素本身的致痛作用，并且降低前列腺素使末梢感受器对缓激肽等致痛因子增敏作用。但阿司匹林的胃肠道、泌尿系统、神经系统等方面的不良反应发生率较高; 同时作为癌痛第一阶梯的主要用药，阿司匹林存在最大有效剂量，此时再增加药物剂量并不能增强其止痛效果，反而使药物的毒性反应明显增加，限制了其临床应用。
氟吡汀和瑞替加滨是唯一被批准用于临床的神经元Kv7通道开放剂，近年来，氟吡汀的镇痛作用已逐渐被证实，并在各种疼痛的临床治疗观察中效果良好。另外有研究表明[4]，氟吡汀能协同增强吗啡、曲马多的镇痛作用。瑞替加滨作为抗癫痫药物已在国外上市，但研究表明瑞替加滨对神经病理性疼痛、炎性疼痛、内脏性疼痛等多种疼痛具有镇痛作用[5-7]。研究表明，Kv7通道在初级传入神经元以及丘脑和脊髓神经元中表达。Kv7.2-5参与IK(M)的产生，IK(M)通过控制动作电位的产生和频率，使细胞复极来降低周围和中枢神经系统兴奋性，从而发挥镇痛作用[8]。
醋酸扭体法是最常见的筛选镇痛药的方法，简便、敏感且重复性好，醋酸刺激引起小鼠腹膜炎症而产生疼痛，表现为腹部收缩内凹、臀部歪扭、腹前壁紧贴笼底和后肢伸张样的扭体反应。醋酸介导的扭体反应可能是由腹腔pH值降低而直接刺激伤害性传入神经元和促进炎症递质的合成导致，是外周疼痛的经典模型。本实验中，阿司匹林、氟吡汀和瑞替加滨都表现出明显的镇痛作用，阿司匹林组扭体次数与后两者相比无明显差异，但更明显延长了小鼠扭体潜伏期时间(P＜0.01)，表现出更强的镇痛作用。与阿司匹林组相比，阿司匹林+瑞替加滨组的扭体潜伏期明显延长(P＜0.01)，阿司匹林+氟吡汀组和阿司匹林+瑞替加滨组扭体次数明显减少(P＜0.01，P＜0.01)，说明氟吡汀、瑞替加滨能增强阿司匹林的镇痛作用，发挥联合镇痛作用。
热板法[9]是利用一定强度的温热刺激动物躯体的某一部位以产生痛反应，以刺激开始至出现反应的潜伏期为测痛指标。在本实验中，阿司匹林较氟吡汀和瑞替加滨并未显示出镇痛优势，但与阿司匹林组相比，阿司匹林+氟吡汀组的舔后足潜伏期延长率均有增加趋势，阿司匹林+瑞替加滨组在30 min和60 min的舔后足潜伏期延长率明显增加(P＜0.05)，进一步证明了氟吡汀、瑞替加滨能增强阿司匹林的镇痛作用。
此外，在两组研究中，我们发现氟吡汀组与瑞替加滨组的镇痛作用未显示出明显差异，但阿司匹林+瑞替加滨组却较阿司匹林+氟吡汀组显示出更强的镇痛效果。我们推测，此现象可能是由于氟吡汀、瑞替加滨的结构不同，与相应受体结合的基团存在差异[10]，从而导致两者与受体的亲和力不同，使得瑞替加滨与阿司匹林联用较氟吡汀与阿司匹林联用显示出更强的镇痛效果。有研究表明[10-11]，瑞替加滨EC50值小于氟吡汀，也支持了我们的推测。
阿片类药物、胆碱及地塞米松与阿司匹林联合应用的镇痛作用已被证实[12-13]。本文研究表明，阿司匹林和Kv7通道开放剂氟吡汀、瑞替加滨单用有镇痛作用，而当阿司匹林和氟吡汀或瑞替加滨联合应用时，氟吡汀或瑞替加滨能增强阿司匹林的镇痛作用，其效果比单用阿司匹林更为明显，这也进一步说明联合用药比单一药物镇痛有更为明显的效果。阿司匹林通过抑制体内前列腺素的生物合成，减少了疼痛信号的产生，同时减少中枢COX-2表达上调以抑制中枢痛觉超敏，而氟吡汀、瑞替加滨则通过开放Kv7通道，提高了IK(M)，使膜静息电位处于超极化状态，降低中枢和周围神经系统神经元兴奋性，抑制了疼痛信号的传导和中枢痛觉超敏。有文献报道[14]，具有不同机制的药物联合应用很可能表现为协同作用，而具有相似机制的药物联合应用表现为相加作用。本实验中，阿司匹林和Kv7通道开放剂通过不同机制发挥镇痛作用，故推断两者的相互作用可能为协同作用。
阿司匹林和Kv7通道开放剂的联合应用符合多模式镇痛的理念，即联合使用不同作用机制的镇痛药物，通过多种机制产生镇痛作用，从而获得更好的镇痛效果，降低药物副作用。本实验采用小剂量阿司匹林进行探究，联合应用效果与阿司匹林的剂量关系仍需进一步探究；另外，虽然氟吡汀、瑞替加滨的副作用相对较少，但它们可能产生抑制平滑肌收缩[15]、肝脏毒性等不良反应，与阿司匹林联合应用的安全性也需进一步验证。
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