2. 河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室, 河北 石家庄 050091
2. Hebei Key Lab of Integrative Medicine on Liver-Kidney Patterns, Shijiazhuang 050091, China
梗阻性肾病是指由于泌尿道结构和(或)功能改变,尿液排泄障碍所致的肾实质病变及功能损害,是导致肾功能衰竭的常见病因。我国肾脏病监测网络2019年发布的关于2015年肾脏病数据报告显示,在慢性肾脏病的诸多病因中,梗阻性肾病已升至第3位,且是农村居民发病的首位病因[1],所以解析其发病机制对于治疗梗阻性肾病有重要意义。前期研究证明,单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)可激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS),诱导醛固酮活化,进而激活盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR),导致细胞增殖[2]等病理改变,依普利酮(eplerenone, EPL)可以阻断这一进程,但是对细胞自噬影响的研究尚少。细胞自噬是真核细胞生物通过溶酶体降解受损的大分子蛋白和细胞器,从而转换为能量供机体重新利用,以维持细胞内环境稳态的过程,然而在持续或强烈应激刺激下,自噬被过度激活而造成细胞自噬性死亡。有研究报道,UUO可激活自噬,随着时间的变化发挥不同的作用[3],也有研究表明在糖尿病肾病中,醛固酮阻断剂螺内酯可通过阻断MR活化,促进细胞自噬的表达,从而保护肾脏[4]。本实验采用UUO模型模拟梗阻性肾病的发病机制及病理改变,观察盐皮质激素受体阻断剂EPL对NR3C2、血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶-1(serum and glucocorticoid-induced protein kinase 1,SGK-1)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、自噬相关基因5(autophagy associated gene 5,Atg5)、Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3(microtubular-associated protein 1 light chain 3,LC3)的调控作用,探讨EPL对梗阻性肾病细胞自噬的调控机制。
1 材料与方法 1.1 实验动物与分组♂清洁级Wistar大鼠36只,体质量(180±20)g,购自河北医科大学动物实验中心,许可证号:SCXK(冀)1205069。随机分为假手术组(Sham group)、模型组(UUO group)和依普利酮组(UUO+EPL group)。
1.1.1 药物EPL选用美国Pfizer公司产品,日本Research Diets.Inc公司根据动物进食量及药物用量(100 mg·kg-1·d-1),按1.25 g·kg-1加入饲料中。
1.1.2 试剂NR3C2(Proteintech公司,批号00016122),SGK-1(Affinty公司,批号19U71),Atg5(Proteintech公司,批号00020300),Beclin-1(Proteintech公司,批号00053036),mTOR(Cell Signaling Technology公司,批号00042580),p-mTOR(Cell Signaling Technology公司,批号0021),LC3(Cell Signaling Technology公司,批号0003),GAPDH(Bioworld Technology公司,批号AB54162),免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号K185910G)。
1.1.3 仪器Leica RM 2245型石蜡切片机(德国Leica上海分公司),Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司),电泳仪及电泳槽(北京六一公司),OLYMPUS VANOX PM-10AD型显微照相仪(日本OLYMPUS公司),VANOX DM-10AD显微镜(日本OLYMPUS株式会社),ODY-3059扫描仪(美国Li-cor公司)。
1.2 造模方法及给药实验大鼠适应性喂养1周后,通过UUO建立梗阻性肾病的动物模型,用10%的水合氯醛以3 mL·kg-1的剂量通过腹腔注射麻醉动物,假手术组于左侧中腹部切开皮肤,仅将输尿管游离但不结扎不切断,逐层缝合皮肤;模型组和依普利酮组于左侧中腹部切开皮肤,游离左侧输尿管,分别在输尿管上1/3及下1/3处用丝线结扎后切断输尿管,逐层缝合皮肤。治疗组给予依普利酮100 mg·kg-1·d-1。10 d后处死动物,摘取梗阻侧的肾脏,一部分组织放入4%多聚甲醛中固定,剩余组织-70 ℃保存待测。
1.3 检测指标及方法 1.3.1 激光共聚焦显微镜检测NR3C2的表达厚5 μm肾组织冰冻切片,NR3C2抗体(1 :100)孵育过夜,PBS清洗后滴加TRITC标记的二抗孵育1 h,PBS清洗后DAPI染核后封片,激光共聚焦显微镜观察NR3C2的表达。
1.3.2 免疫组化检测SGK-1、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3的表达采用SABC法检测,石蜡切片脱蜡,梯度脱水,修复抗原,滴加一抗SGK-1、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3(1 :100),4 ℃孵育过夜;PBS清洗后二抗孵育1 h,滴加SABC复合物,DAB显色,苏木精复染,脱水,透明,封片,以光镜下出现棕黄色颗粒为阳性表达。
1.3.3 Western blot检测SGK-1、mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3的表达取冰冻肾组织100 mg, 加裂解液(含蛋白酶抑制剂)0.4 mL,提取蛋白并测定含量,配制相应浓度的浓缩胶和分离胶,加入上样蛋白,电泳后转膜,5%脱脂牛奶封闭,分别加入SGK-1、mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3抗体(1 :1 000),4 ℃过夜,次日TBS清洗3次,加入相应二抗(1 :20 000)孵育,TBS清洗3次,显影,与内参进行校正。
1.4 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行统计学分析,计量资料采用方差分析,计数资料采用卡方检验等。所有数据资料以x±s表示,各组数据首先进行正态性及方差齐性检验,若方差整齐选择单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD检验;若方差不齐选择非参数检验方法。
2 结果 2.1 激光共聚焦显微镜检测NR3C2表达NR3C2在假手术组表达于肾小管远端上皮细胞的胞质,核内未见表达;与假手术组相比,模型组表达明显增强,主要见于细胞核;依普利酮组NR3C2在细胞核内表达明显减弱(Fig 1)。
2.2 免疫组化检测SGK-1表达SGK-1在假手术组呈弱表达,主要见于远端肾小管;模型组表达明显增强而依普利酮组SGK-1表达明显减弱(Fig 2)。
2.3 免疫组化检测p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3表达p- mTOR在假手术组呈阳性表达,见于肾小管上皮细胞的胞质;模型组p-mTOR表达明显减弱,依普利酮组表达较模型组增强(Fig 3)。
Atg5和Beclin-1在假手术组呈弱表达,均见于肾小管上皮细胞的细胞质;模型组表达明显增强;依普利酮治疗后Beclin-1和Atg5的表达明显减弱(Fig 3)。
LC3在假手术组呈弱表达,见于肾小管上皮细胞的细胞质和细胞膜;模型组表达明显增强,以肾小管上皮细胞的细胞膜为主要表达部位;依普利酮组表达明显减弱(Fig 3)。
2.4 Western blot检测SGK-1、mTOR、p-mTOR、Atg5、Beclin-1、LC3蛋白表达采用Western blot检测SGK-1、Atg5、Beclin-1的蛋白表达,结果经内参校正后显示:与假手术组相比,模型组SGK-1、Atg5和Beclin-1表达明显增强(P<0.05),与模型组相比,依普利酮组表达明显减弱(P<0.05)(Fig 4, Tab 1)。
Group | SGK-1/GAPDH | Atg5/GAPDH | Beclin-1/GAPDH |
Sham | 0.47±0.06 | 0.16±0.02 | 0.11±0.02 |
UUO | 0.92±0.12* | 0.81±0.10* | 0.62±0.11* |
UUO+EPL | 0.68±0.09# | 0.52±0.09# | 0.38±0.09# |
*P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs UUO |
采用Western blot检测LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ,mTOR和p-mTOR的蛋白表达,结果显示与假手术组相比,模型组LC3 Ⅱ/Ⅰ明显增强(P<0.05),依普利酮可以纠正其比例(P<0.05);p-mTOR/mTOR在假手术组表达基本相同,p-mTOR、mTOR以及比值在模型组表达明显减弱(P<0.05),依普利酮可以纠正其失衡(P<0.05)(Fig 4, Tab 2)。
Group | p-mTOR/mTOR | LC3 Ⅱ/Ⅰ |
Sham | 0.96±0.13 | 2.32±0.31 |
UUO | 0.65±0.14* | 4.65±0.54* |
UUO+EPL | 1.11±0.18# | 2.64±0.25# |
*P<0.05 vs sham; #P<0.05 vs UUO |
输尿管梗阻导致肾脏压力增高,血管中有效循环血容量下降,从而激活RAAS,刺激醛固酮分泌增多,诱导MR活化,继而发挥病理生理作用。MR属于核受体超家族,主要在肾脏远端肾单位的上皮细胞中,包括远曲小管、主细胞和闰细胞的连接小管及集合管[5]。醛固酮的作用不单是调节水盐平衡,在高血压、炎症损伤、氧化应激等方面也发挥着重要作用。
盐皮质激素受体NR3C2是配体依赖的转录因子,在生理状态下与伴侣蛋白热休克蛋白(heat shock protein, HSP)结合,主要存在于细胞质,当受到醛固酮等刺激后,与HSP分离,进入核内,进而发挥促炎、促氧化应激等一系列病理生理作用。此外,Rac1以及氧化应激等都可以诱导MR活化并通过不同方式发挥作用,如通过L型钙通道引起高血压[6]、通过ENaC蛋白通道导致盐敏感性高血压[7]、通过炎症反应诱导脏器损伤[8]等。当MR被激活之后,其效应介质SGK-1表达明显增强[9],观察其表达对于研究醛固酮是否与MR结合并诱导氧化应激、炎性损伤和肾间质纤维化的程度及治疗有重要的参考作用。
依普利酮是一种新型的盐皮质激素受体拮抗剂,不良反应小,耐受性好,对雄激素和黄体酮受体的亲和力极低,能有效抑制MR活化,进而抑制由其带来的细胞增殖、表型转化、凋亡等病理改变,保护肾功能。本实验结果显示UUO后NR3C2表现为核转位,SGK-1表达增强,依普利酮可以抑制NR3C2活化和SGK-1的表达。
Atg5是自噬溶酶体降解途径中的重要调节基因,Atg5与Atg12形成的蛋白复合物Atg5-Atg12,通过与Tecpr1结合促进自噬体与溶酶体的融合,而在缺失Atg5的细胞中,这一过程无法正常进行[10]。在自噬体的延伸阶段,Atg5、Atg12和Atg16结合形成三元复合物并与自噬体外膜结合,不仅促进自噬泡的延伸和扩张,使自噬泡由开始的小囊泡发展为半环状结构;还促进了LC3向自噬泡募集,参与自噬泡膜的弯曲,促进自噬的进展[11]。此外,Atg5作为细胞自噬和凋亡的转换开关,在自噬的发生和发展中起重要的调控功能[12]。Beclin-1是自噬启动的必需基因,通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(ⅢPI3K)结合形成Beclin1-ⅢPI3K复合物,调节自噬的水平。Beclin-1是第1个被发现的参与自噬对疾病调控的自噬基因,在自噬溶酶体降解途径中对肿瘤有抑制作用[13]。LC3是自噬体膜的重要标记物,以LC3Ⅰ和LC3 Ⅱ两种形式存在,LC3在羧基端被具有蛋白内切酶活性的Atg4剪切,生成存在于细胞质的LC3Ⅰ;LC3Ⅰ通过Atg7和Atg3参与的泛素样反应,使磷脂酰乙醇胺偶联,生成脂质化形式的LC3 Ⅱ;LC3 Ⅱ是自噬体的结构蛋白,可以附着到自噬体膜上,通过监测LC3Ⅰ向LC3 Ⅱ的转化可以检测自噬的进展[14],所以通常用Western blot检测LC3 Ⅱ/Ⅰ或mRFP-GFP-LC3双荧光实验评估自噬的表达。mTOR是自噬的负调控通路,通过磷酸化激活下游的激酶,调节细胞的生长分化、增殖、自噬等过程。mTOR激酶是细胞能量和营养代谢的感受器,当机体处于营养充足的环境时,mTOR可以抑制自噬;当机体处于缺血缺氧等病理条件下,mTOR激酶活性受到抑制,自噬被激活[15]。本实验结果表明UUO后Atg5、Beclin-1、LC3表达增强,p-mTOR表达减弱,依普利酮可调控这一过程,减缓梗阻性肾病中细胞自噬的表达。
本实验采用UUO制备梗阻性肾病的动物模型,激活RAAS,诱导MR活化,观察依普利酮对梗阻性肾病细胞自噬的影响,结果表明,依普利酮可抑制MR活化,减弱自噬基因和蛋白表达,减缓梗阻性肾病病理进展。
( 致谢: 衷心感谢河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室各位老师的支持与帮助!)
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