2. 吉林省过敏性疾病重点实验室, 延吉 133002;
3. 延边大学医学院解剖学教研室, 延吉 133002
2. Jilin Key Lab of Anaphylactic Diseases, Yanji, Jilin 133002, China;
3. Dept of Anatomy, College of Medicine, Yanbian University, Yanji, Jilin 133002, China
肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种慢性、进行性和致死性的肺部疾病。它主要表现为过度分泌促纤维化介质，成纤维细胞的活化和增殖，凋亡抵抗性肌成纤维细胞的持续存在，病灶内炎症细胞的募集等。其发病机制尚不明确[1]。特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性间质性肺病，以普通型间质性肺炎的组织病理学模式为特征。在肺组织损伤早期，出现炎症细胞募集，导致趋化因子和促炎细胞因子释放，进而炎症细胞大量募集、重塑和肺纤维化。IPF确诊后，其平均生存期仅为2.8年，死亡率较大多数肿瘤略高，因此IPF被称为一种“类肿瘤疾病”。而目前在临床上用于抗纤维化药物主要是吡非尼酮和尼达尼布[2]，其虽然有助于改善肺功能，缓解疾病症状，但不能显著提高患者的生存率[3]。所以明确IPF发病机制，寻找靶向治疗IPF的药物成为了研究重点。
转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的活化是最直接的促进肺组织纤维化因素，其作用于成纤维细胞，分泌大量胶原蛋白质(collagenI A1，COL1A1)或者诱导其分化为肌成纤维细胞，表达α-平滑肌肌动蛋白；而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，例如P38 MAPK能被TGF-β1磷酸化；核转录因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是p38 MAPK的下游信号通路，在炎症和纤维化中发挥重要作用[4, 5]。
FTY-720(Fingolimod)是近年来新开发的免疫抑制剂，它是来源于中药冬虫夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分ISP-I改造而成，其对自身免疫性心肌炎、多发性硬化、葡萄膜视网膜炎和动脉粥样硬化具有显著的保护作用[6]。FTY720是1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的结构类似物，在体内被鞘氨醇激酶-2磷酸化形成FTY720-磷酸盐(FTY720-p)，FTY720-p是S1P1、S1P3受体的激动剂，同时也是S1P1受体的功能拮抗剂。FTY720-p以高亲和力结合S1P1R，诱导受体内化并使免疫细胞对S1P变得不敏感。FTY-720通过靶向TGF-β1信号通路改善肾纤维化[7], 而对肺纤维化的研究尚不清楚。
本研究拟探讨FTY-720对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响及其作用机制，并探讨了其机制与TGF-β1/P38 MAPK/NF-κB信号通路的相关性。
1 材料与方法 1.1 实验材料、试剂 1.1.1 实验动物由延边大学实验动物中心提供40只清洁干净雄性BALB/c小鼠，体质量(18±5) g，许可证号：SCXK(吉)2017-0003。经延边大学医学院伦理委员会批准，本实验开始进行，并遵守《实验动物管理条例》。
1.1.2 材料与试剂博来霉素(Sigma, 美国)(货号：203401)；FTY-720(Sigma, 美国)(货号：SML0700批号：0000026872)；IL-1β(货号：KMC0011)、TNF-α(货号：BMS607-3) ELISA试剂盒(Invitrogen, 美国)；Masson染色液(索来宝, 中国)(货号：G1345批号：20180418)；anti-TGF-β1(货号：3711批号：7), anti-P38 MAPK(货号：9212), anti-p-P38 MAPK(货号：9215批号：7), anti-NF-κBp65(货号：6956), anti-β-actin(货号：4970批号：17) (Cell Signaling, 美国); anti-COL1A1 (Abcam, 美国)(货号ab34710批号：GR158873-9)。
1.1.3 仪器2135型旋转切片机(德国徕卡公司)；分光光度计(Thermo公司)；酶联免疫吸附测定仪RT-2100C(美国雷杜公司)；5415D低温高速多功能离心机(Eppendorf公司)；Western blot转膜仪(Bio-Rad公司)；Amersham Imager 600自动化学发光凝胶成像分析仪(General Electric公司)；TXD3细胞图片离心机(湘仪集团)。
1.2 实验方法 1.2.1 动物分组及模型制备将40只雄性BALB/c小鼠随机分为8组：生理盐水对照组(Control)、BLM模型组(BLM)、生理盐水+FTY-720对照组(NS+FTY-720)、博来霉素+FTY-720组(BLM+FTY-720)，7天、14天分批处死，每组5只。各组小鼠适应性饲养1周后，Control组和NS+F组小鼠于第0天气管内给予生理盐水(100 μL)，第1、3、5天分别腹腔注射生理盐水(100 μL)和FTY-720(1 mg·kg-1，100 μL)；BLM组和BLM+FTY-720组于第0天气管内给予博来霉素(10 mg·kg-1，100 μL)，1、3、5天分别腹腔注射生理盐水(100 μL)和FTY-720(1 mg·kg-1，100 μL)；给药第7天和第14天小鼠进行处死，提取肺组织等备用于实验。
1.2.2 标本收集各组小鼠分别在给药7天和14天处死。小鼠吸入乙醚麻醉，颈部皮肤进行消毒并切开，钝性分离皮下组织，暴露气管，行气管切开术，轻轻插入肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)软管，结扎固定软管，缓慢向肺组织中注射4℃生理盐水1 mL，并轻轻按摩小鼠胸腔，重复3次，使抽出的肺泡灌洗液不低于0.6 mL。收集的肺泡灌洗液用低温高速多功能离心机，以3 000 r·min-1离心5 min，将上清液保存在-80 ℃，离心后的沉淀物用于制备细胞涂片。收集BALF溶液后，取出小鼠的左肺并置于甲醛中固定，取出右肺并储存在-80 ℃的环境中。
1.2.3 肺组织学检查固定小鼠左肺48 h后，流水冲洗24 h。经常规脱水、包埋等步骤后，切片、铺片以备用于HE和Masson染色。从每只小鼠中随机选择3张切片，并在光学显微镜下观察它们的组织学变化。
1.2.4 BALF中蛋白质含量及总细胞数测定将在-80 ℃冷冻的BALF上清液在室温水浴中快速解冻，通过BCA法测定蛋白质含量。离心BALF后，将生理盐水溶液加入沉淀中，稀释至200 μL，混合并置于细胞涂片离心机中。1 000 r·min-1离心10 min，再1 500 r·min-1离心5 min。将涂好的细胞涂片进行瑞士-吉姆萨染色，并在光学显微镜下进行总细胞计数。
1.2.5 BALF中IL-1β、TNF-α含量的测定酶联免疫吸附实验(ELISA)测定小鼠肺组织BALF中的IL-1β和TNF-α水平。通过使用由标准蛋白质产生的标准曲线计算浓度。
1.2.6 免疫组化检测肺组织中COL1A1的表达将肺组织切片放于60 ℃的干燥器中熔蜡。然后二甲苯脱蜡；梯度浓度酒精脱水至PBS缓冲液，抗原高火修复15分钟(柠檬酸盐缓冲液)，自然降温。PBS缓冲液洗片，然后与用一抗标记的一抗孵育过夜。最后，将切片用DAB染色，用苏木精复染，脱水，洗涤并用二甲苯固定。随机选择5个不同的视野观察。
1.2.7 Western blot检测肺组织中TGF-β1、p-P38 MAPK和NF-κB表达根据每个试剂盒的要求，裂解并提取小鼠肺组织蛋白质，将相同量的蛋白质(40 μg)在10%的SDS-PAGE中以70 V恒压电泳，切取目的条带。300 mA低温条件下转膜。在脱脂奶粉封闭液中常温封闭1.5 h。分别用小鼠TGF-β1、β-actin、P38 MAPK、p-P38 MAPK、NF-κB p65抗体4 ℃孵育过夜，将膜取出，在TBST中充分洗涤。洗膜后，加入HRP标记的相应二抗并在室温下温1.5 h。将膜取出，在TBST中洗涤后，使用Amersham Imager 600自动化学发光凝胶成像分析仪进行曝光。
1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 6.0进行统计学分析。实验结果计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 FTY-720对博莱霉素诱导肺纤维化的作用 2.1.1 FTY-720对肺组织病理学改变的影响Fig 1A小鼠肺组织切片HE染色显示，与对照组比较，BLM 7d肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚，可见大量炎性细胞渗出，成纤维细胞增多，至14 d，组织结构破坏明显，肺间质胶原纤维大量沉积。给予FTY-720明显改善肺组织结构紊乱，减少肺间质胶原沉积。如Fig 1B Masson染色可见，对照组肺组织结构正常，模型组蓝色胶原纤维沉积不断增多，至14 d胶原纤维沉积最多，呈弥漫性分布，同时肺泡结构破坏明显。给予FTY720，能明显缓解上述肺组织病理变化。
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| Fig 1 HE staining and Masson staining of lung tissues in mice of control group, BLM group, NS+FTY-720 group and BLM+FTY-720 group A. HE stainingof lung tissues in mice; B. Masson staining of lung tissues in mice. The scale bar=100 μm. |
Fig 2A和Fig 2B结果与对照组相比，BLM小鼠肺组织BALF中蛋白质含量和细胞数显著增加；给予FTY-720后，能显著降低博来霉素诱导小鼠BALF中蛋白质含量和总细胞数。
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| Fig 2 Determination of protein content and total cell number in BALF(x±s, n=5) A. Determination of total protein content in BALF; B. Determination of total cell number in BALF. **P < 0.01 vs control groups. ##P < 0.01 vs BLM groups. |
检测了小鼠肺组织BALF中的细胞因子含量。如Fig 3A和Fig 3B结果所示，相比于对照组小鼠，模型组小鼠BALF中IL-1β、TNF-α含量明显上调；而FTY-720能够明显降低博来霉素诱导小鼠BALF中IL-1β和TNF-α水平。
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| Fig 3 Determination of IL-1β and TNF-α levels in BALF by ELISA(x±s, n=5) A. Determination of IL-1β levels in BALF; B. Determination of TNF-α levels in BALF. **P < 0.01 vs control groups. ##P < 0.01 vs BLM groups. |
Fig 4免疫组织化学结果显示，模型组7 d和14 d小鼠肺组织与对照组比较，COL1A1的阳性表达明显增加，而FTY-720处理后显著降低阳性表达。
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| Fig 4 COL1A1 positive expression Immunohistochemical detection of COL1A1 expression in lung tissues. The scale bar=100μm. |
Western blot实验结果显示，BLM诱导小鼠肺组织中TGF-β1蛋白的表达水平较对照组明显上体，FTY-720抑制小鼠TGF-β1蛋白表达水平，如Fig 5所示。
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| Fig 5 Expression of TGF-β1 proteins detected by Western blot(x±s, n=5) A. Expression levels of TGF-β1 proteins in mouse lung tissues on day 7 and day 14; B. Quantitative analysis of A. **P < 0.01 vs control groups. ##P < 0.01 vs BLM groups. |
Fig 6结果显示，模型组中7 d小鼠肺组织中p-P38 MAPK表达水平明显升高，到14 d略下降；而FTY-720能够明显降低肺纤维化小鼠肺组织p-P38 MAPK的表达。
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| Fig 6 Expression of p-P38 MAPK proteins detected by Western blot(x±s, n=5) A. Expression levels of p-P38 MAPK proteins in mouse lung tissues on day 7 and day 14; B. Quantitative analysis of A. **P < 0.01 vs control groups. #P < 0.05 vs BLM groups. |
Fig 7结果显示，7 d模型组核内NF-κB p65的水平与生理盐水对照组相比明显增多，14 d模型组核内NF-κBp65的水平较7 d略有降低，但与对照组比较明显上调；给与FTY-720后能明显抑制NF-κB p65的表达。
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| Fig 7 Expression of NF-κBp65 proteins detected by Western blot(x±s, n=5) A. Expression levels of NF-κB p65 proteins in mouse lung tissues on day 7 and day 14; B. Quantitative analysis of A. **P < 0.01 vs control groups. ##P < 0.01 vs BLM groups. |
肺纤维化是一大类肺疾病的终末期改变，以成纤维细胞增殖、细胞外基质(ECM)大量聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏严重为特征，在全球范围内患病人数不断攀升[8]。在本实验中，BLM诱导小鼠肺纤维化模型，所建立的实验模型是早期肺纤维化范畴。本实验HE和Masson染色结果7 d主要表现为炎性细胞浸润，14 d胶原纤维沉积急剧增加。因此，早期肺纤维化是以炎性细胞渗出为起点，研究表明，肺纤维化发生过程的关键阶段正是因为早期肺纤维化的形成[9]。所以本实验主要研究早期肺纤维化发生机制。
有研究表明，博来霉素诱导的肺纤维化中IL-1β以及TNF-α水平明显升高[10]。成纤维细胞表面受体结合IL-1β，参与结缔组织再生成。肺纤维化发生过程中，IL-1β起到介导炎症及损伤，促进修复的作用；而过度修复则引起间质纤维化。TNF-α可直接作用于肺成纤维细胞，促进其增殖；也可以通过偶联表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)发挥作用。因此本实验测定了BALF中IL-1β、TNF-α水平，ELISA结果显示BLM诱导小鼠肺组织BALF中IL-1β、TNF-α水平显著升高；在BLM组中，给药7 d比14 d小鼠BALF中IL-1β、TNF-α水平高，说明炎症反应的高峰期在7 d；FTY-720下调上述因子水平。上述结果说明博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，开始以肺部炎症为主要病理表现，而到14天时肺组织炎症逐渐演变为肺纤维化，呈现肺组织细胞外基质过度度沉积。广泛纤维化的特征是以细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积, 主要成分为CollagenI A1[11]。本实验的模型组小鼠肺组织中CollagenI A1大量沉积，而给予FTY-720显著降低了CollagenI A1的水平。同样，博来霉素诱导BALF中的总蛋白浓度、总细胞数增加，FTY-720明显降低上述水平。综上所述，FTY-720抑制炎症细胞的激活并参与肺纤维化的发展。
近年来，TGF-β1/ Smad2 / Smad3被认为是促进肺纤维化的经典信号传导途径。除Smad外，越来越多的证据表明，TGF-β1还能激活各种Smad非依赖性信号通路[12]。因此，本课题组详细分析了非经典途径TGF-β1/ P38 MAPK / NF-κB信号通路通过肺部炎症反应或肺损伤促纤维化的潜在分子机制。研究表明，抑制P38 MAPK和NF-κB可以保护肝脏损伤和抗纤维化[13]。在本实验中发现博来霉素激活TGF-β1/P38 MAPK/NF-κB信号通路，而FTY-720通过抑制上述信号转导通路，抑制炎症因子的产生，保护对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。
本研究证实了FTY-720对小鼠肺纤维化的保护作用，其机制与TGF-β1//P38 MAPK/NF-κB信号通路有关，表明FTY-720可能成为治疗肺纤维化的新希望。
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