在过去的几十年中,糖尿病(diabetes mellitus,DM)已成为全球公共医疗问题的主要关注点之一[1]。DM是一种慢性、常见的非传染性疾病,是以血糖水平升高为特征的葡萄糖代谢紊乱性疾病。据国际糖尿病联合会报告,2011年估计有3.66亿个病例,到2030年预计将增长到5.52亿个病例[2]。此外,5%的死亡病例由DM引起,并且这一数据正在迅速增长。1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)是一种自身免疫性疾病,其特征是体内免疫细胞攻击胰岛中产生胰岛素的β细胞,导致胰岛β细胞发生凋亡。引起胰岛β细胞发生凋亡的主要原因包括①炎症刺激:巨噬细胞、细胞毒性T细胞,诱导产生可溶性的中介因子杀伤β细胞[3];②氧化应激:高糖、高脂环境、间歇性低氧、活性氧簇表达增加等可诱导胰岛β细胞发生氧化应激反应[4];③内质网应激也可引起胰岛β细胞凋亡。
维生素D(vitamin D,VitD)是一种重要的生理调节剂,其受体存在于多种组织细胞中,包括肠、骨、肾、造血组织以及胰腺β细胞。VitD是由胆固醇前体(7-脱氢胆固醇)合成的脂溶性类固醇,其具有化学类固醇结构[5]。人体中主要形式的VitD是VitD2或麦角钙化醇,由植物中的麦角甾醇合成,而VitD3或胆钙化醇是由动物胆固醇合成[5]。VitD的活性形式是1, 25(OH)2VitD3,通过不同的机制在葡萄糖稳态中发挥重要作用。它不仅可以改善靶细胞(如骨骼肌、肝脏和脂肪组织)的胰岛素敏感性,还可以直接通过对β细胞的作用和间接地通过作用于不同的免疫细胞(包括巨噬细胞)来保护β细胞免受有害的免疫攻击。此外,VitD还可直接通过核内维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)刺激胰岛素分泌[6]。大量研究提示,VitD是T1DM、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)和妊娠期糖尿病的重要影响因素,1, 25(OH)2VitD3通过与体内VDR结合,参与调节免疫功能,并在胰岛素的合成、分泌中发挥了重要作用[7],但其作用机制及在DM防治中的地位尚存许多争议,本实验主要探讨VitD是否能减少由过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)诱导的胰岛β细胞凋亡,预防DM的发生,为T1DM的防治提供新的思路和途径。
1 材料与方法 1.1 实验试剂DMEM高糖培养基购自Hyclone公司(货号:SH30022.01);胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)购自Gemini公司(货号:900-108);胰酶细胞消化液(产品编号:C0201)、青霉素-链霉素溶液(100×)(产品编号:C0222)、Bax(货号:AB026)、Caspase-3(货号:AF0081)购自碧云天公司;维生素D(货号:D1530-10UG)、过氧化氢溶液(货号:323381)、Hoechst 33258溶液(货号:94403-1ML)购自Sigma公司;CCK-8试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)购自日本同仁公司(货号:CK04);Annexin V-FITC/PI apoptosis assay kit购自NeoBioscience公司(货号:FAK011);高效裂解液(RIPA)购自Thermo Fisher Scientific公司(批号:TK274910);PMSF购自Solarbio公司(货号:P0100);BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:CW0014S)、SDS-PAGE凝胶购自康为世纪公司(货号:CW0022S);PVDF膜(货号:BS-PVDF-45;BS-PVDF-22)、ECL发光液购自millipore公司(货号:WBLUR0100);一抗Bcl-2(货号:3498T)、Cleaved caspase-3(货号:9661T)购自CST公司,β-actin购自Origeng公司(货号:TA811000);山羊抗鼠二抗购自SAB公司(货号:L3032-1),山羊抗兔二抗购自absin公司(货号:abs20002ss)。
1.2 实验仪器超净工作台购自苏州安泰公司;倒置显微镜、荧光显微镜购自Olympus公司;CO2培养箱购自Thermo(America)公司;高速冷冻离心机购自Eppendorf(German)公司;Cytation3购自Bio-Tek (USA)公司;细胞流式检测仪购自BD FACSCalibur公司;双垂直蛋白电泳购自北京君意东方电泳设备有限公司;高灵敏度化学发光成像仪购自Tanon-6200公司。
1.3 细胞培养与处理小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞购自ATCC细胞库。MIN6细胞在含有15%胎牛血清、1% 100 mg·L-1链霉素、1% 100 U·mL-1青霉素的DMEM高糖培养基,5% CO2、37℃、95%饱和湿度条件下培养[3, 7]。细胞贴壁生长至密度达到80%左右,按1 :3的比例传代。以1×104/孔接种96孔细胞培养板,2×105/孔接种6孔细胞培养板中培养MIN6细胞24 h。当MIN6细胞贴壁生长12 h后,采用VitD预处理后,用H2O2处理细胞不同时间。
1.4 CCK-8法检测细胞活力接种于96孔板中的MIN6细胞用不同浓度的H2O2处理,观察H2O2对MIN6细胞活力的影响,VitD预处理后加H2O2处理3、6、12、24、48 h,观察VitD对MIN6细胞活力的影响。到时间后,每孔加入10 μL CCK-8,放入培养箱培养2 h,用Cytation 3检测450 nm波长处各组的吸光度(A)值。细胞增殖率/%=(AH2O2处理组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。上述实验重复3次。
1.5 Hoechst 33258检测细胞凋亡6孔板中的MIN6细胞分为3组:①空白对照组;②VitD(5 nmol·L-1)预处理3 h再加H2O2(100 μmol·L-1)处理24 h组;③H2O2(100 μmol·L-1)处理24 h组做细胞爬片,到时间后PBS洗涤细胞,加入0.5 mL 4%多聚甲醛室温固定15~30 min,弃去固定液,PBS洗涤细胞,吸尽液体,加入0.5 mL Hoechst 33258染色液,室温避光染色15 min,染色后,PBS洗涤细胞,吸尽液体,滴一滴50 μL抗荧光淬灭封片液封片,光镜下观察细胞的形态学改变,荧光显微镜检测各组细胞核内染色质固缩情况(呈致密浓染)。上述实验重复3次。
1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率实验分组见1.5,药物处理后收集细胞于流式管,PBS洗涤细胞两次后,用结合缓冲液重新悬浮细胞,加5 μL Annexin V-FITC,避光孵育15 min左右,用结合缓冲液洗涤细胞,再加10 μL浓度为20 mg·L-1的碘化丙锭,轻轻混匀后上流式细胞仪进行检测分析。Flowjo 7.6分析流式结果。上述实验重复3次。
1.7 Western blot按5×105个细胞/瓶将MIN6细胞均匀接种到培养皿中,细胞贴壁后用VitD预处理3 h,然后用H2O2处理24 h,收集细胞和培养基,离心,裂解后提取总蛋白,采用Cytation3检测总蛋白水平。按30~50 μg的蛋白上样量,确定对照组及实验组蛋白的上样体积,根据目的蛋白分子量大小,采用不同浓度的SDS-PAGE分离胶分离各组总蛋白,湿转法将分离胶上的蛋白转至PVDF膜上,脱脂牛奶封闭1~2 h。然后孵一抗,抗体按1 :500或1 :1 000进行稀释,室温孵育2 h或4 ℃过夜,TBST洗涤3次,每次15 min,根据一抗来源,再加HRP标记的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗,按1 :5 000进行稀释,室温孵育45 min~1 h,TBST洗涤3次,每次15 min,采用Tanon-6200检测蛋白表达并分析结果。上述实验重复3次。
1.8 统计学分析采用GraphPad Prism 5.0、Image J、Flowjo 7.6进行统计分析,所有数据均采用
在MIN6细胞中,首先检测了不同浓度的H2O2处理24 h对细胞活力的影响。结果表明,随着H2O2浓度的增加,MIN6细胞活力降低(Fig 1A)。当H2O2浓度为100 μmol·L-1时,细胞活力降低至60%左右,因此,选用100 μmol·L-1 H2O2的浓度用于后续实验。同时,还检测了100 μmol·L-1 H2O2作用不同时间对MIN6细胞活力的影响。结果表明,随着H2O2作用时间的延长,MIN6细胞活力降低(Fig 1B)。当用100 μmol·L-1 H2O2作用24 h时,细胞活力降低至60%左右,因此,选用100 μmol·L-1 H2O2作用24 h用于后续实验。
2.2 VitD减少H2O2诱导的细胞凋亡检测不同浓度VitD处理24 h对MIN6细胞活力的影响(Fig 2A),结果表明VitD无细胞毒性。向细胞中加入不同浓度的VitD预处理24 h后用100 μmol·L-1 H2O2处理MIN6细胞24 h,CCK-8法检测细胞活力。结果表明,当VitD浓度为5 nmol·L-1时细胞活力达到80 %左右,因此选用5 nmol·L-1 VitD用于后续实验(Fig 2B)。用5 nmol·L-1 VitD预处理细胞不同时间,再用100 μmol·L-1 H2O2处理MIN6细胞24 h,检测细胞活力,结果表明,当VitD预处理3h时,与H2O2组相比,结果差异有显著性(P < 0.01)(Fig 2C)。因此,后续实验选用浓度5 nmol·L-1 VitD预处理细胞3 h,探讨VitD对MIN6细胞的保护作用。
2.3 Hoechst 33258染色观察MIN6细胞核形态Hoechst 33258染色后,如图 3所示,发现Control组细胞核内染色质分布均匀,单独H2O2处理24 h组与VitD预处理3h后H2O2处理24 h组比,细胞核内染色质固缩、呈致密浓染的细胞增加(如红色箭头所示)。
2.4 流式细胞术观察MIN6细胞凋亡百分率H2O2(100 μmol·L-1)单独处理,VitD(5 nmol·L-1)预处理3 h后H2O2处理MIN6细胞24 h,观察细胞凋亡百分率。结果表明,VitD预处理3 h后H2O2处理24 h组凋亡百分率为7.78 %,H2O2单独处理24 h组凋亡百分率为20.2 %,细胞坏死率低于8.4%,由此可知,H2O2诱导的细胞死亡是由凋亡引起的,而VitD预处理3 h后,H2O2再处理能减少细胞凋亡。
2.5 H2O2单独与用VitD预处理后对凋亡相关蛋白表达的影响H2O2(100 μmol·L-1)单独处理,与VitD(5 nmol·L-1)预处理3 h后加H2O2处理MIN6细胞24 h,观察凋亡相关蛋白表达。Western blot结果表明,与Control组比,H2O2组Bcl-2、Bcl-2/Bax比值降低(P < 0.05或P < 0.01, Fig 5A),Bax(P < 0.05,Fig 5A)、Cleaved caspase-3(P < 0.05或P < 0.01, Fig 5B)、Cleaved caspase-3/caspase-3比值增加(P < 0.01,Fig 5B),Caspase-3表达差异无显著性(Fig 5B)。与H2O2组比,VitD+H2O2组Bcl-2、Bcl-2/Bax比值上调(P < 0.05或P < 0.01, Fig 5A),Bax(P < 0.01,Fig 5A)、Cleaved caspase-3(P < 0.01,Fig 5B)、Cleaved caspase-3/caspase-3(P < 0.01,Fig 5B)比值下调。由图可知,VitD能减少由H2O2诱导的Bcl-2表达下调,Bax和Cleaved caspase-3表达上调。
3 讨论自身免疫性T1DM和代谢紊乱性T2DM长期以来被认为在疾病流行、发病、体重、胰岛炎的存在和自身抗体方面显示出明显的差异。然而,最新数据表明,T1DM和T2DM可能在疾病发病机制中表现出更多的相似之处[9]。现在越来越明显的是,T2DM患者也出现炎症,早期疾病发作和胰岛自身免疫[10]。相比之下,T1DM患者更常见于儿童肥胖,并且曾经被称为青少年糖尿病,但也可以在成年患者中检测到T1DM。
T1DM主要是通过破坏胰岛β细胞,使得胰岛素分泌减少,导致DM的发生。在非肥胖DM小鼠、人类胰岛素依赖型DM小鼠模型,自发性DM中使用1, 25(OH)2D3或其类似物的许多试验中已经证明了这一点[11]。相反,1, 25(OH)2D3抗性小鼠发生DM的风险较高,在生命早期存在缺陷时更具侵略性[12]。早期使用的1, 25(OH)2D3通过对胰岛β细胞和免疫细胞的双重作用来预防或减轻胰腺胰岛炎的严重性[13]。此外,在自身免疫性疾病发作(称为前驱DM状态)后,使用1, 25(OH)2D3与环孢菌素A可以预防DM的发生。DM患者维生素D缺乏的可能机制之一是结合蛋白减少,这已经在DM大鼠中得到证实[14]。Mathieu等[15]证明活性VitD可阻止动物模型中的T1DM。然而,VitD是否能够减少由H2O2诱导的小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞凋亡的作用机制尚未完全清楚,需进一步研究。
细胞凋亡是一种基因调控的细胞死亡过程,也称为程序性细胞死亡,发生在所有活细胞中并受基因调控,其特征是一系列细胞形态变化,包括染色体浓缩,核碎裂,细胞皱缩,形成凋亡小体等。两种不同的死亡信号通路导致细胞凋亡:外在死亡受体依赖途径和内在的线粒体依赖途径。对于内在的线粒体依赖性途径,细胞色素c从线粒体释放到胞质中是凋亡小体形成和Caspase-3激活的基础。在Bcl-2家族中,Bax是促凋亡蛋白,Bcl-2是抗凋亡蛋白。Bax或Bcl-2可以控制线粒体通透性并促进细胞色素c的通过。因此,Bax/Bcl-2比率决定了许多细胞的命运。Bax和Bcl-2蛋白的失衡可能导致线粒体膜电位的丧失和细胞色素c的释放,从而引发Caspase-3活化并导致细胞凋亡。
本实验选用小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞,首先通过CCK-8法检测H2O2对MIN6细胞活力的影响。然后用VitD预处理,结果表明,与单独的H2O2处理组比,VitD预处理后用H2O2处理,MIN6细胞活力显著增加。然后用Hoechst 33258染色细胞核,观察细胞核形态,VitD预处理后用H2O2处理,与单独的H2O2处理组比,染色质固缩的细胞明显减少,接着采用流式细胞术通过Annexin V-FITC/PI 2种荧光染料共染色MIN6细胞,检测细胞凋亡率。VitD预处理后用H2O2处理细胞凋亡百分率显著低于单独的H2O2处理组。Western blot结果显示,单独的H2O2处理Bcl-2表达降低,Bax、Cleaved caspase-3表达增加,VitD预处理后用H2O2处理Bcl-2表达增加,Bax、Cleaved caspase-3表达降低。
综上所述,VitD通过增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达,降低促凋亡蛋白Bax及Cleaved caspase-3表达,减少由H2O2诱导的小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞凋亡,减少DM的发生,从而为T1DM的防治提供新的思路和途径。
( 致谢: 本实验主要在糖尿病分子机制研究实验室完成,感谢老师及同学的支持与帮助。)
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