2. 黑龙江省中医药科学院, 黑龙江, 哈尔滨 150036
2. Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150036, China
绝经后骨质疏松症(post menopausal osteoporosis,PMOP)是由于绝经后妇女雌激素水平显著降低,导致骨形成和骨吸收的动态平衡破裂,引起女性骨钙流失严重,造成骨质疏松症[1]。研究表明[2],豆豉含有丰富的有效成分,包括大豆异黄酮、维生素K2、纳豆激酶、钙等微量元素。其中,大豆异黄酮是具有生理功能的植物雌激素,如预防骨质疏松、抗氧化和调节血脂等。本研究通过去除大鼠卵巢构建PMOP动物模型,并基于代谢组学技术探究豆豉对PMOP的干预作用和机制,为豆豉治疗POMP的药效学研究及POMP新药研发提供科学的实验和理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物由哈尔滨医科大学实验动物科学系提供的32只SPF级健康SD ♀大鼠,体质量(180~200) g。动物合格证书号为SCXK(黑)2013-001。
1.2 药品与试剂拜耳医药保健有限公司广州分公司,戊酸雌二醇片(补佳乐)药品,国药准字J20130009,批号255B;哈药集团制药总厂,青霉素钠药,国药准字H23021441,批号17121212-1;广州屈臣氏食品饮料有限公司,蒸馏水;山东利尔康医疗科技有限公司,碘伏消毒液试剂;天津市光复精细化工研究所,水合氯醛试剂;实验用哈尔滨三联药业股份有限公司,0.9%氯化钠注射液试剂;南京建成生物工程研究所,血清骨钙素(OC,批号:20180810)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP,批号:20180820)试剂盒;碱性磷酸酶(ALP,批号:HC02T01)、无机磷(P,批号:HC23S01)、钙(Ca,批号:HC10S01)试剂盒,上海华臣生物试剂有限公司;肌酐检测试剂盒(酶法, 批号:058250),协和梅迪克斯医疗器械(上海)有限公司。
1.3 仪器与设备中国Holigic公司,ASY-00409型双能X线骨密度仪;青岛海尔特种电器有限公司,DW-86L959型超低温冰箱;Medel 450型酶标仪,瑞典Bio-Rod公司提供;IKA®MS3 digital型涡旋振荡器,广州仪科实验室技术有限公司;上海赛默生物科技发展有限公司,Biofuge®Stratos型全能台式高速低温离心机;美国RAININ公司,E4XLS型移液器;日本日立公司,7060全自动生化分析仪。
1.4 豆豉制备方法将大豆煮熟后,经106~108 CFU·ML-1枯草芽孢杆菌发酵而成,由黑龙江省中医药科学院提供,批号:20180501。
1.5 动物分组及给药参考文献[3],适应性喂养1周后,32只SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、雌二醇组及豆豉组,每组8只。各组大鼠腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)并固定仰卧位。75%酒精消毒,沿下腹正中线切口2~3 cm。除假手术组,首先暴露“Y”型子宫角,结扎子宫角,取出双侧卵巢,只切除假手术组卵巢周围少许脂肪组织。闭合切口并逐层缝合,腹腔内注射青霉素钠(4万U/只)5 d。术后所有大鼠在室温(22.5~24.0) ℃及湿度的53.0%~54.5%的SPF级饲育室饲养。
发酵后的豆豉经真空冷冻干燥后,获得豆豉超微冻干粉,出粉率为41%。术后饲养1周后开始给药,根据豆豉成年人日服用量为30 g·d-1,戊酸雌二醇(补佳乐)成人日用量为1 mg·d-1,按照实验动物学中的体表面积的换算方法,故豆豉给药组大鼠给药剂量每天为2.7 g·kg-1,雌二醇组大鼠每天为0.09 mg·kg-1,大鼠每日灌胃量为10 mL·kg-1。将适量0.5% CMC-Na水溶液加入到超微冻干的豆豉粉末中,超声30 min,配制成含豆豉冻干粉110 g·L-1及雌二醇0.009 g·L-1灌胃液,模型组和假手术组大鼠灌胃相同体积0.5% CMC-Na水溶液8周。
1.6 生物样本采集与处理在最后一次灌胃后,大鼠禁食12 h,自由饮水。将大鼠置于代谢笼内收集12 h的尿液,4 ℃,3 500 r·min-1离心10 min,取上清液并置-80 ℃冰箱备用。通过颈椎脱臼法处死大鼠,将左侧股骨分离出来,剥离组织,用0.9%生理盐水湿润纱布并包裹离体股骨,置-80 ℃冰箱备用,用于骨密度测定。另取大鼠子宫并精确称重以计算子宫指数。
1.7 观察指标及检测方法(1) 体质量:记录在实验第0天、第2周、第4周、第6周、第8周大鼠体质量,绘制大鼠体质量生长曲线。(2)子宫指数:取出子宫后立即称定大鼠子宫湿重,并根据公式计算子宫指数(子宫湿重/大鼠体质量)。(3)骨密度(BMD):取出冷冻的股骨,在4 ℃的冰箱中解冻,将股骨放置薄壁有机玻璃盒内,装入去离子水约4.0 cm,在Hologic双能X线骨密度仪平台上放置股骨, 并沿平台长轴放置,对大鼠股骨进行扫描,采用Hi-Res(高分辨),Small animal模式扫描,并测量股骨密度。
1.8 数据处理实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行处理,实验结果以x±s表示,实验结果中,通过单因素方差(One-Way ANOVA)分析每组数据。
1.9 尿液代谢组学研究 1.9.1 尿液样本的处理取出冻存尿液,于4 ℃冰箱中解冻,从所有组别大鼠尿液样本中各取50 μL,涡旋60 s,标记为尿液QC样本,每组另取1 mL尿样,并通过0.22 μm微孔滤膜,取滤液5 μL供UPLC-Q/TOF-MS分析。
1.9.2 分析条件色谱检测条件色谱柱:ACQUITY UPLC C18柱;色谱分离条件为:柱温为30 ℃;流速0.2 mL·min-1;流动相组成A:0.1%甲酸-水,B:0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脱程序:0~2 min,5%~10%B;2~9 min,10%~30%B;9~16 min,30%~100%B;16~18 min,100%B;18~18.1 min,100%~5%B;18.1~20 min,5%B。
质谱条件 在正、负离子模式下采用电喷雾离子源采集数据。正离子模式:离子源电压(ISVF)为5 500 V,温度(TEM)为550 ℃,裂解电压(DP)为100 V,碰撞能量(CE)为40 eV,碰撞能量扩展(CES)为20 eV。氮气为雾化气体,辅助气Gas1(55 psi),辅助气Gas2(55 psi),气帘气(CUR)为35 psi。负离子模式:离子源电压(ISVF)为-4 500 V,碰撞能量(CE)为-40 eV,碰撞能量扩展(CES)为-20 eV,裂解电压(DP)为-100 V;其他参数同于正离子模式。扣除动态背景(DBS),一级质谱Ion Scan Range为m/z 100~1 000 Du,IDA值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描,Ion Scan Range为m/z 100~1 000 Du。数据采集软件为Analyst TF 1.6 software工作站;采用CDS质量校正系统在线校正。
1.9.3 代谢组学数据处理本实验以生物标志物及其变化规律为切入点,应用代谢组学方法,充分采用UPLC-Q-TOF/MS手段,通过现代信息科学和生物统计学方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘。对尿液样品进行检测,将UPLC-Q-TOF/MS分析所得数据导入Progenisis QI软件,对原始采集数据进行校正,包括色谱峰提取、峰匹配、峰对齐、峰识别以及数据归一化等,主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析法(OPLS-DA)用于降低所获得的多维复杂数据的维度,绘制出反映组间离散程度的得分图(score plots), 最后根据鉴定结果联合人类代谢组数据库(HMDB)、KEGG等数据库及大量文献对生物标志物进行生物学意义的解释,实现对数据统计分析。
2 结果 2.1 豆豉对去卵巢骨质疏松大鼠体质量的影响每组大鼠生存状态良好、正常饮食、二便正常,体质量模型组增加。模型组大鼠在给药第4周,6周,8周显示出明显的体质量增加,且明显高于假手术组(P<0.05,P < 0.01)。与模型组相比,雌二醇组和豆豉给药组大鼠体质量下降。
2.2 豆豉对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度和子宫指数的影响如Tab 2, 给药8周后,与假手术组相比,模型组大鼠股骨BMD及子宫指数下降(P<0.01)。与模型组相比,戊酸雌二醇组BMD和子宫指数增加,BMD与模型组相比差异有显著性(P<0.05);豆豉组大鼠BMD和子宫指数高于模型组(P<0.01)。
Group | 0 week | 2 weeks | 4 weeks | 6 weeks | 8 weeks |
Control | 217.13±3.04 | 226.12±14.86 | 245.51±17.11 | 280.50±13.36 | 283.00±20.00 |
Model | 202.87±10.72** | 242.37±9.79* | 301.12±16.24** | 331.75±13.02** | 351.12±13.34** |
Estradiol | 201.75±9.97 | 237.37±21.45 | 282.37±21.12 | 293.62±29.08 | 316.75±29.85# |
Soybean meal | 200.87±9.63 | 229.25±21.17 | 285.75±24.84 | 301.12±35.14# | 326.12±40.67 |
* P < 0.05, ** P < 0.01 vs control; # P < 0.05 vs model |
Group | BMD(g·cm-2) | Uterine index |
Control | 0.25±0.02 | 1.76±0.31 |
Model | 0.18±0.03** | 0.33±0.09** |
Estradiol | 0.24±0.01# | 0.81±0.23 |
Soybean meal | 0.25±0.01## | 0.70±0.26## |
* P < 0.05, ** P < 0.01 vs Control; # P < 0.05, ## P < 0.01 vs Model |
采用UPLC-Q-TOF-MS法进行尿液样本的分离与数据采集,假手术组、模型组、雌二醇组及豆豉组具有代表行的总离子流图(Fig 1)。对比发现,模型组大鼠尿液代谢谱图与假手术组相比存在明显差异,结果表明取出卵巢后雌性大鼠体内代谢轮廓及相关代谢物存在明显变化。
2.3.2 大鼠体内代谢轮廓经时变化分析运用EZinfo2.0软件对模型组大鼠尿液代谢轮廓的经时轨迹变化进行分析,结果显示给药第8周的尿液代谢轮廓与给药d 0相聚较远,提示大鼠去卵巢后,随着时间延长体内代谢轮廓发生明显扰动且逐渐远离初始代谢轮廓区域,进而导致骨质疏松症的发生与发展。此外,对给药第8周模型组、假手术组、雌二醇组和豆豉组大鼠代谢轮廓进行PCA分析,结果显示模型组与假手术大鼠代谢轮廓区分明显,豆豉和雌二醇组大鼠代谢轮廓远离模型组而趋向于假手术组,结果提示豆豉可显著回调模型大鼠体内异常代谢轮廓,进而干预了绝经后骨质疏松症的发生与发展(Fig 3)。
2.3.3 潜在生物标志物的筛选为了进一步明确区分各组差异,对假手术组、模型组大鼠尿液代谢物进行无监督的OPLS-DA。结果显示出模型组与假手术组具有很好的区分。结合S-plot和VIP-plot分析结果,筛选VIP>1且P<0.05差异性代谢物。最终筛选得到23个差异生物标志物(Tab 3)。
No. | tR/min | Mass(ku) | Formula | Name | HMDB | MS/MS | Trend |
1 | 1.31 | 193.034 9 | C6H10O7 | D-glucuroni-c acid | HMDB00127 | 193[M-H]- 113[M-H-COOH-2OH]- 103[M-H-C3H6O3]- | ↓ |
2 | 1.33 | 195.050 9 | C6H12O7 | Galactonic acid | HMDB00565 | 195[M-H]- 177[M-H-OH]- 159[M-H-2OH]- 89[M-H-2OH-C3H2O2]- | ↓ |
3 | 1.67 | 191.019 7 | C6H8O7 | Citric acid | HMDB00094 | 191[M-H]- 173[M-H-OH]- 147[M-H-COOH]- 129[M-H-OH-COOH] | ↑ |
4 | 1.80 | 175.024 5 | C6H8O6 | Ascorbic acid | HMDB00044 | 175[M-H]- 157[M-H-OH]- 115[M-H-OH-C2H5O]- 175[M-H-OH-C2H3O2]- | ↓ |
5 | 2.04 | 169.033 8 | C5H4N4O3 | Uric acid | HMDB00289 | 169[M+H]+ 152[M+H-NH2]+ 141[M+H-CO]+ 96[M+H-CO-CH3NO]+ | ↑ |
6 | 8.20 | 365.231 1 | C21H32O5 | Dihydrocorti-sol | HMDB03259 | 365[M+H]+ 329[M+H-2OH]+ 257[M+H-2OH-CH3O-C2H3O]+ | ↓ |
7 | 8.44 | 363.216 | C21H30O5 | Aldosterone | HMDB00037 | 363[M+H]+ 317[M+H-OH-CHO]+ 85[M+H-OH-CHO-C15H20O2]+ | ↓ |
8 | 9.50 | 271.059 6 | C15H10O5 | Genistein | HMDB03217 | 271[M+H]+ 243[M+H-CO]+ 225[M+H-CO-OH]+ 153[M+H-C8H6O]+ | ↓ |
9 | 11.19 | 303.192 3 | C19H26O3 | 2-Methoxye-stradiol | HMDB00405 | 303[M+H]+ 285[M+H-OH]+ 119[M+H-2OH-CH3-C9H9O]+ 81[M+H-2OH-CH3-C12H13O]+ | ↓ |
10 | 11.42 | 255.064 5 | C15H10O4 | Daidzein | HMDB03312 | 255[M+H]+ 227[M+H-CO]+ 209[M+H-CO-OH]+ 145[M+H-OH-C6H5O]+ | ↑ |
11 | 11.60 | 285.075 4 | C16H12O5 | Glycitein | HMDB05781 | 285[M+H]+ 253[M+H-CH3O]+ 118[M+H-CH3O-C7H3O3]+ 105[M+H-CH3O-C7H3O3-CH2]+ | ↑ |
12 | 11.73 | 269.155 1 | C18H22O2 | Estrone | HMDB00145 | 269[M-H]- 251[M-H-OH]- | ↑ |
13 | 11.77 | 349.236 | C21H32O4 | 17alpha, 21-dihydroxypreg-nenolone | HMDB06762 | 349[M+H]+ 253[M+H-C2H6O4]+ 159[M+H-C2H6O4-C7H10]+ 145[M+H-C2H6O4-C7H10-CH3]+ | ↓ |
14 | 12.70 | 287.199 | C19H28O2 | Androstenedione | HMDB00053 | 287[M+H]+ 269[M+H-O]+ 227[M+H-C2H5O2]+ 185[M+H-C2H5O2-C3H5]+ | ↓ |
15 | 12.78 | 331.226 | C21H30O3 | Deoxycorticosterone11 | HMDB00016 | 331[M+H]+ 295[M+H-2OH]+ | ↓ |
16 | 12.84 | 347.221 2 | C21H30O4 | 21-deoxycortis-ol | HMDB04030 | 347[M+H]+ 329[M+H-OH]+ 311[M+H-OH-H2O]+ 287[M+H-OH-C2H3O]+ | ↓ |
17 | 13.28 | 450.321 1 | C26H43NO5 | Chenodeo-xycholic acid glycine conjugate | HMDB00637 | 450[M+H]+ 414[M+H-2OH]+ | ↓ |
18 | 13.49 | 333.240 9 | C21H32O3 | 17-hydroxypregnenolone | HMDB00363 | 333[M+H]+ 297[M+H-2H2O]+ 255[M+H-2H2O-C2H2O]+ 199[M+H-2H2O-C2H2O-C4H7]+ | ↓ |
19 | 13.53 | 331.226 0 | C21H30O3 | Deoxycort-icosteron-e | HMDB00016 | 331[M+H]+ 313[M+H-OH]+ 295[M+H-2OH]+ 271[M+H-OH-C2H2O]+ 243[M+H-2OH-C4H5]+ | ↓ |
20 | 14.05 | 315.231 | C21H30O2 | Progestero-ne | HMDB01830 | 315[M+H]+ 297[M+H-O]+ 273[M+H-C2H2O]+ | ↓ |
21 | 14.23 | 347.221 | C21H30O4 | Corticoste-rone | HMDB01547 | 347[M+H]+ 329[M+H-OH]+ 311[M+H-2OH]+ 269[M+H-2OH-C2H3O]+ 241[M+H-2OH-C2H3O-C2H3]+ | ↓ |
22 | 14.56 | 317.245 7 | C21H32O2 | Pregnenol-one | HMDB00253 | 317[M+H]+ 299[M+H-OH]+ 281[M+H-2OH]+ 257[M+H-2OH-C2H3]+ | ↓ |
23 | 15.04 | 317.245 8 | C21H32O2 | 20alpha-dihydropro-gesterone | HMDB03069 | 317[M+H]+ 281[M+H-2OH]+ 135[M+H-2OH-C11H14]+ 107[M+H-2OH-C11H14-C2H4]+ | ↓ |
以17-羟基孕烯醇酮(17-Hydroxypregnenolone)为例简述二级解析过程。
以通过对比潜在生物标记物在模型组与假手术组中的峰面积,其中去卵巢后模型组大鼠体内5个标记物表达水平明显上升,18个标记物表达水平显著下降。
2.3.4 代谢通路分析基于MetPA平台,进一步将23个绝经后骨质疏松症潜在代谢标记物进行代谢通路拓扑分析,结果显示,23个尿液代谢标记物主要参与9个代谢途径,包括类固醇激素生物合成、抗坏血酸与醛酸代谢、乙醛酸和二羧酸盐代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、初级胆汁酸生物合成、嘌呤代谢、淀粉与蔗糖代谢、肌醇磷酸代谢、三羧酸循环(Tab 4)。
No. | Pathway Name | Total | Hits | P | Impact |
1 | Steroid hormone biosynthesis | 70 | 13 | 1.354 4E-12 | 0.459 36 |
2 | Ascorbate and aldarate metabolism | 9 | 2 | 0.007 92 | 0.4 |
3 | Glyoxylate and dicarboxylate metabolism | 16 | 1 | 0.224 65 | 0.296 3 |
4 | Citrate cycle (TCA cycle) | 20 | 1 | 0.272 77 | 0.053 56 |
5 | Primary bile acid biosynthesis | 46 | 1 | 0.732 69 | 0.029 76 |
6 | Purine metabolism | 68 | 1 | 0.860 05 | 0.020 77 |
7 | Pentose and glucuronate interconversions | 14 | 1 | 0.199 46 | 0.0 |
8 | Starch and sucrose metabolism | 23 | 1 | 0.306 97 | 0.0 |
9 | Inositol phosphate metabolism | 26 | 1 | 0.339 64 | 0.0 |
基于本研究筛选出去卵巢骨质疏松症大鼠尿液生物标志物,运用MetPA平台,对给予豆豉模型生物标记物变化进行Heatmap分析,结果发现,豆豉给药组尿液生物标记物含量发生明显变化(Fig 6)。统计学分析结果表明,豆豉可显著回调12个潜在生物标志物。
基于MetPA平台分析发现豆豉主要通过调节类固醇激素生物合成、抗坏血酸与醛酸代谢、戊糖和葡糖醛酸盐转化、淀粉与蔗糖代谢和肌醇磷酸代谢5个代谢通路起到预防绝经后骨质疏松症作用。
3 讨论 3.1 豆豉对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢相关因子的影响去势方法是目前构建PMOP动物模型最常用方法[4-6]。雌激素水平骤然降低,对成骨细胞的刺激减弱,骨吸收大于骨形成,导致骨质疏松症,因此去势大鼠被美国FDA规定为研究骨质疏松症的首选动物模型[7]。3月龄♀大鼠更成熟,激素代谢水平变得稳定。本实验中,将3月龄雌性大鼠切除双侧卵巢,8周后测量骨密度,结果显示,模型组大鼠左侧股骨骨密度低于假手术组,骨量减少表明成功构建骨质疏松症动物模型。
豆豉是由大豆煮熟后经芽孢杆菌发酵而成,富有营养价值。研究证明,豆豉具有预防疾病和保健功能,如预防骨质疏松症、溶解血栓、抗癌、降血压等[8]。实验证实,给予豆豉后卵巢切除动物的骨密度和骨强度可明显增加[9],人食用豆豉后,骨密度显著增加,骨质疏松性骨折的风险显著降低[10]。本实验通过对去势雌性大鼠灌胃豆豉,饲养8周后,豆豉组、戊酸雌二醇组大鼠骨密度、子宫指数比模型组均增加。与模型组相比,豆豉可抑制去势大鼠骨量丢失,导致大鼠骨质密度增加,子宫指数提高。
3.2 尿液代谢组学潜在生物标志物的生物学意义黄体酮是一种类似孕酮的孕激素。研究表明,黄体酮可通过不同方式调节骨代谢:①恢复骨重建至正常水平;②增加降钙素的释放,调节PTH活性;③增加肠钙吸收;④降低破骨活性抑制破骨细胞因子;⑤刺激有局部作用的生长因子诱导成骨细胞增长[11]。研究表明,模型组大鼠尿液中黄体酮水平降低,提示大鼠去卵巢后可引起黄体酮水平降低,影响骨重建、降钙素释放和肠钙的吸收,使骨吸收超过骨形成,导致PMOP。豆豉组与模型组相比黄体酮水平升高,提示豆豉在降低骨重建、提高降钙素的释放和增加肠钙吸收方面发挥了作用。
脱氢表雄酮(DHEA)是一种类固醇激素,通过肾上腺皮质网状带中的芳香化酶催化胆固醇合成的。DHEA在酶的作用下最终转化为雄烯二酮、雌酮、雌二醇(E2)等,因此DHEA可有效平衡体内激素水平,进而防治PMOP[12]。本研究表明,模型组大鼠尿液中DHEA水平降低,提示大鼠去卵巢后可引起DHEA水平降低,进而引起雌激素含量下降,导致PMOP。豆豉组与模型组相比DHEA水平升高,提示豆豉在提高体内雌激素水平含量方面发挥了作用。
11-脱氧皮质酮是由肾上腺产生的类固醇激素,具有盐皮质激素活性,最终可转化为醛固酮。实验证实,黄体酮可以在酶的作用合成脱氧皮质酮,然后转化为皮质酮,最后通过醛固酮合酶转化为醛固酮[13]。成骨细胞和破骨细胞中鉴定出的矿物质类皮质激素受体(MRs),表明醛固酮对骨转换有影响。研究表明,醛固酮信号通路NR3C2和PIK3R1参与骨代谢的调节,其中,NR3C2编码盐皮质激素受体,醛固酮通过与成骨细胞和破骨细胞上的盐皮质激素受体结合促进成骨细胞分化,而PIK3R1调节成骨细胞和破骨细胞分化的磷脂酰肌醇激酶3的亚基参与骨代谢的调节[14]。本研究结果显示,模型组大鼠尿液中醛固酮水平降低,提示大鼠去卵巢后可引起醛固酮水平降低,调节醛固酮信号通路NR3C2和PIK3R1,进而导致PMOP。豆豉组与模型组相比醛固酮水平升高,说明豆豉可通过调节NR3C2和PIK3R1醛固酮信号通路,使骨代谢回调到正常水平,进而防治PMOP。
综上所述,本研究发现豆豉可明显逆转12个标记物异常表达,例如11-脱氧皮质酮、黄体酮、2-甲氧基雌二醇、21-羟基孕烯醇酮、21-脱氧皮质醇和脱氧皮质酮等,其主要通过调节类固醇激素生物合成、抗坏血酸与醛酸代谢、戊糖和葡糖醛酸盐转化、淀粉与蔗糖代谢和肌醇磷酸代谢起到预防骨质疏松症作用。结果表明豆豉对雌激素水平下降诱导的骨质疏松症有良好的防治作用,本研究首次阐明了豆豉防治PMOP作用机制,为进一步发现临床有效且毒副作用小的抗PMOP药物提供一定的科学依据。
( 致谢: 在黑龙江省中医药科学院中药所分析室及动物室实验过程中,本人衷心地感谢给予我老师及全体同学!)
[1] |
周延萌, 宁慧娴, 张小敏, 等. 鹰嘴豆芽素A对雌激素缺乏诱发大鼠骨质疏松症的作用[J]. 中国药理学通报, 2014, 30(12): 1775-6. Zhou Y M, Ning H X, Zhang X M, et al. Effect of garbanzoin A on osteoporosis induced by estrogen deficiency in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30(12): 1775-6. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2014.12.032 |
[2] |
张建东, 张天东, 陶若奇, 等. 大豆异黄酮对绝经后妇女骨的影响[J]. 中国骨质疏松杂志, 2013, 19(6): 616-8. Zhang J D, Zhang T D, Tao R Q, et al. Effects of soy isoflavones on bone in postmenopausal women[J]. Chin J Osteoporosis, 2013, 19(6): 616-8. doi:10.3969/j.issn.1006-7108.2013.06.020 |
[3] |
毛海琴, 杜义斌, 徐莹, 等. 骨疏颗粒对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢及子宫指数的影响[J]. 新中医, 2015, 47(2): 213-5. Mao H Q, Du Y B, Xu Y, et al. Effects of Gushu Granule on bone metabolism and uterus index in ovariectomized osteoporosis rats[J]. New J Tradit Chin Med, 2015, 47(02): 213-5. |
[4] |
Estai MA, Suhaimi F, Das S, et al. Expression of TGF-β1 in the blood during fracture repair in an estrogen-deficient rat model[J]. Clin (Sao Paulo), 2011, 66(12): 2113-9. |
[5] |
Zhao Q, Shen X, Zhang W, et al. Mice with increased angiogenesis and osteogenesis due to conditional activation of HIF pathway in osteoblasts are protected from ovariectomy induced bone loss[J]. Bone, 2012, 50(3): 763-70. doi:10.1016/j.bone.2011.12.003 |
[6] |
Samadfam R, Awori M, Bénardeau A, et al. Combination treatment with pioglitazone and fenofibrate attenuates pioglitazone-mediated acceleration of bone loss in ovariectomized rats[J]. J Endocrinol, 2012, 212(2): 179-86. |
[7] |
郭辉, 苟丽, 熊鑫鑫, 等. 洋葱干预后对去势大鼠骨质疏松的影响[J]. 中国骨质疏松杂志, 2016, 22(4): 406-9, 46. Guo H, Gou L, Xiong X X, et al. Effects of onion intervention on osteoporosis in ovariectomized rats[J]. Chin J Osteoporosis, 2016, 22(4): 406-9, 46. doi:10.3969/j.issn.1006-7108.2016.04.005 |
[8] |
南芝润, 侯磊, 任莹, 等. 纳豆及其产物的研究与应用[J]. 山西农业科学, 2017, 45(10): 1721-24, 36. Nan Z R, Hou L, Ren Y, et al. Research and application of natto and its products[J]. Shanxi Agric Sci, 2017, 45(10): 1721-24, 36. doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.36 |
[9] |
Kawano M, Itomine I, Monma M, et al. Effects of combined treatment with fermented soybean (natto) intake and exercise on bone metabolism in ovariectomized rats[J]. SAGE Open Med, 2017, 40(5): 205031211772564. |
[10] |
Yukihiro I, Masayuki I, Akemi M, et al. Intake of fermented soybeans, natto, is associated with reduced bone loss in postmenopausal women:Japanese population-based osteoporosis (J POS) Study[J]. J Nutr, 2006, 136(5): 1323-8. doi:10.1093/jn/136.5.1323 |
[11] |
孔冰冰, 黄元龙, 谢惠科, 等. 降钙素与性激素合用治疗骨质疏松症的临床疗效观察[J]. 实用医技杂志, 2008(24): 3265-6. Kong B B, Huang Y L, Xie H K, et al. Clinical observation of the combination of calcitonin and sex hormones in the treatment of osteoporosis[J]. J Pract Med Techn, 2008(24): 3265-6. doi:10.3969/j.issn.1671-5098.2008.24.082 |
[12] |
赵军, 师建平. 脱氢表雄酮对绝经后骨质疏松作用研究进展[J]. 内蒙古医科大学学报, 2015, 37(3): 278-82. Zhao J, Shi J P. Progress in the study of dehydroepiandrosterone onpostmenopausal osteoporosis[J]. J Inner Mongolia Med Univ, 2015, 37(3): 278-82. |
[13] |
Yamakita N, Chiou S, Gomez-Sanchez C E. Inhibition of aldosterone biosynthesis by 18-Ethynyl deoxycorticosterone[J]. Endocrinol, 1991, 129(5): 2361-6. doi:10.1210/endo-129-5-2361 |
[14] |
樊长萍, 侯建明. 原发性醛固酮增多症与骨质疏松症的相关性[J]. 中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志, 2016, 9(2): 199-204. Fan C P, Hou J M. Correlation between primary aldosteronism and osteoporosis[J]. Chin J Osteoporosis Bone Miner Dis, 2016, 9(2): 199-204. doi:10.3969/j.issn.1674-2591.2016.02.016 |