长期大量的酒精摄入对肝脏有直接损害作用,其损伤机制主要是肝细胞内脂质代谢紊乱所导致脂肪沉积。由于人体代谢能力有限,长期以高蛋白、高脂膳食为主,饮酒等习惯会引起大量脂肪堆积,从而导致脂肪肝。高脂饮食和酒精摄入可协同诱导氮化应激、线粒体应激、内质网应激等,但酒精对高脂引起的脂肪肝的影响及其潜在机制却尚不清楚。二氢槲皮素(dihydroquercetin或taxifolin,TAX)是落叶松、花旗松中含量较高的二氢黄酮醇类化合物[1]。本研究通过小鼠高脂饲料喂养联合酒精狂饮模型,探讨TAX对肝脏脂肪积蓄的干预机制。
1 材料 1.1 药物与试剂TAX(纯度>98%,成都普思公司);谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂条(Arkray公司);甘油三酯(TG)试剂盒(南京建成研究所);固醇调节元件结合蛋白-1(sterol-regulatory element binding protein 1,SREBP-1)抗体(Abcam公司)。
1.2 实验动物SPF级ICR小鼠, ♂,8~10周龄,购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司[SCXK(吉)-2016-0003]。
2 方法 2.1 动物分组将48只小鼠随机分为8组,即正常组(N)、对照饲料组(LFD)、高脂饲料组(HFD)、模型组(HFD+ETOH)、TAX组(25、50、100 mg·kg-1)、单独给药组(TAX100),每组6只。
2.2 造模及给药每天1次对TAX组与TAX100组进行不同浓度的TAX灌胃,共给药4次。小鼠处死前一晚禁食,可自由饮水。d 4处死当日末次灌胃给药1 h后,N组、HFD组及TAX100组灌胃麦芽糊精,其余5组各灌胃浓度为31.25%的酒精(5 g·kg-1,20 mL·kg-1)。9 h后处死小鼠,收集血液和肝脏。
2.3 血清及肝脏指标测定全自动生化分析仪SP-4430(Arkray)检测ALT、AST、TG的含量。
2.4 肝脏组织的病理观察参照李秀侠等[2]的方法,将肝脏石蜡切片用HE染色;肝脏冷冻切片进行油红O染色。显微镜下观察分析病理学变化。
2.5 免疫组织化学实验石蜡包埋肝组织,切片,60 ℃烘片,常规免疫组化染色,在显微镜下观察SREBP-1表达情况。利用Image Pro-Plus 6.0软件对小鼠肝脏中的SREBP-1阳性表达进行分析。
2.6 统计学分析数据以
Tab 1结果显示,与模型组相比,TAX给药组ALT、AST活性降低,HFD+ETOH+TAX25组,HFD+ETOH+TAX100组均具有统计学意义(P<0.01)。与正常组相比,模型组的血清及肝脏的TG含量明显增高(P<0.01),TAX给药组与模型组比较,HFD+ETOH+TAX25组、HFD+ETOH+TAX50组、HFD+ETOH+TAX100组血清的TG含量都明显降低(P<0.01),且HFD+ETOH+TAX25组肝脏的TG含量也呈下降趋势(P<0.05)。
Group | ALT(serum) | AST(serum) | TG(serum) | TG(liver) |
N | 10.00 | 50.80±6.14 | 57.68±5.08 | 2.16±1.03 |
LFD | 12.25±2.63** | 51.67±5.77** | 85.60±15.64## | 4.97±2.19# |
HFD | 10.00** | 54.20±6.61** | 102.98±14.05## | 7.59±2.30## |
HFD+ETOH | 66.00±19.8## | 125.00±19.80## | 90.34±11.17## | 7.19±0.30## |
HFD+ETOH+TAX25 | 34.50±17.68#** | 87.75±16.5##** | 65.45±9.34** | 4.50±0.58* |
HFD+ETOH+TAX50 | 19.33±16.17** | 115.33±17.19## | 57.55±12.93** | 8.70±0.67## |
HFD+ETOH+TAX100 | 19.25±8.90** | 78.50±18.98#** | 65.06±8.36** | 6.78±0.31## |
TAX100 | 10.00** | 63.75±8.30** | 53.60±6.63** | 2.27±0.98** |
#P<0.05, ##P<0.01 vs N; *P<0.05, **P<0.01 vs HFD+ETOH |
HE染色结果可见,与正常组相比,模型组肝细胞肿胀,胞质内分布有许多脂肪空泡,肝小叶界限模糊。TAX给药组随着浓度增高,肝组织病理变化明显减弱。油红O染色结果显示,模型组染色的脂滴较正常组明显增多。TAX给药后染色变浅,且有一定的剂量依赖性,说明小鼠肝脏脂质含量明显下降。
3.3 TAX对小鼠肝脏SREBP-1表达的影响免疫组化检测显示,与正常组细胞质中只有少量散在分布浅黄色颗粒相比,模型组中央静脉附近有大量棕黄色颗粒沉积,表明小鼠肝组织中SREBP-1表达明显增加(P<0.01)。与模型组相比,TAX给药组的SREBP-1染色明显较浅,且其中的HFD+ETOH+TAX25组有统计学意义(P<0.01),染色结果呈与正常组相接近的趋势(Tab 2)。
Group | Positive expression area of SREBP-1 |
N | 49.00±14.18 |
LFD | 203.67±69.67##** |
HFD | 1487.00±253.59## |
HFD+ETOH | 1365.33±230.67## |
HFD+ETOH+TAX25 | 848.00±216.69##** |
HFD+ETOH+TAX50 | 1127.33±213.57## |
HFD+ETOH+TAX100 | 1260.00±229.58# |
TAX100 | 439.67±119.48##** |
#P<0.05, ##P<0.01 vs N; **P<0.01 vs HFD+ETOH |
流行病学研究表明,高蛋白、高胆固醇摄入与肝纤维化、肝炎风险增加有关,其已被证明可诱导严重的脂肪变性、炎症和纤维化[3-4]。饮酒和高脂肪饮食是导致脂肪肝的主要因素,无论是否患有非酒精性脂肪肝病,长期酗酒都可能导致酒精性肝病。据Chang等[5]报道,在高脂饲料喂养的情况下,酒精狂饮可引发急性肝损伤,凸显了肥胖/超重个体酗酒的风险。本研究显示,小鼠模型组的肝脏内脂滴沉积,炎性细胞浸润,说明酒精与高脂饲料饲养小鼠成功建立脂肪肝,且TAX给药组的小鼠肝脏内脂肪沉积随着TAX浓度的增加而有所改善。综上所述,TAX能够改善并逆转高脂饲料联合酒精狂饮所引起的脂肪蓄积,对肝脏具有一定的保护作用,其在治疗酒精性与非酒精性脂肪肝方面具有一定的潜力,确切机制有待深入探索。
[1] |
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[2] |
李秀侠, 文雪华, 王燕平, 等. 果寡糖对水飞蓟宾治疗非酒精性脂肪肝的增效作用研究[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(11): 1535-41. Li X X, Wen X H, Wang Y P, et al. Modulation of fructo-oligosaccharide during silybin-meditated improvement of nonalcoholic fatty liver[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(11): 1535-41. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.012 |
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[4] |
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Chang B, Xu M J, Zhou Z, et al. Short- or long-term high-fat diet feeding plus acute ethanol binge synergistically induce acute liver injury in mice: an important role for CXCL1[J]. Hepatology, 2015, 62(4): 1070-85. doi:10.1002/hep.27921 |