2. 福建医科大学基础医学院 科研中心,福建 福州 350122;
3. 福建医科大学基础医学院 实验教学中心,福建 福州 350122;
4. 福建医科大学基础医学院 脑老化与神经变性疾病重点实验室,福建 福州 350122
鲁萌萌(1993-),女,福建医科大学2016级硕士研究生,研究方向:病理生理学,E-mail:1756372021@qq.com;
孙维姗(1999-),女,福建医科大学2017级本科生,临床医学专业,E-mail:fjFZSunWS@163.com。
2. Research Center, Fujian Medical University of Basic Medical Sciences, Fuzhou 350122, China;
3. Experimental Teaching Center, Fujian Medical University of Basic Medical Sciences, Fuzhou 350122, China;
4. Key Laboratory of Brain Aging and Neurodegenerative Diseases, Fujian Medical University of Basic Medical Sciences, Fuzhou 350122, China
神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是具有自我更新、能分化为神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞潜能的一类细胞群。随着对NSCs的认识,人们纠正了关于脑神经不能再生的错误认识:神经发生是持续存在的,脑内NSCs可不断生成神经元,取代受损或丢失的神经元。因此,随着NSCs在体外培养的成功,NSCs移植为治疗不同的神经系统疾病或损伤提供新方法[1]。阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年期痴呆疾病中最常见类型,是一种进行性智能衰退的中枢神经系统疾病,其主要病理特征:大脑海马和新皮层神经元出现β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)以及神经原纤维缠结(nerve fiber tangles,NFTs),病变的发展最后导致神经突触数量明显减少,神经细胞死亡和皮层萎缩。研究发现[2-3],AD脑组织的Aβ,会抑制成熟小鼠大脑皮层和人胚脑的NSCs增殖、分化,并诱导其凋亡;将过表达胆碱乙酰转移酶的NSCs移植入AD模型大鼠海马组织,可分化为神经元、星形胶质细胞,提高脑脊液的乙酰胆碱水平,提高AD模型大鼠的认知能力[4]。因此,NSCs增殖分化不仅受其生长的微环境影响,也受基因影响。在临床上,已证实补充适量类固醇激素,如性激素可改善与脑老化有关的认知障碍。类固醇受体辅助活化因子-1(steroid receptor coactivator-1,SRC-1;又称NCoA-1[5])是各种类固醇激素作用于核受体后调节靶基因转录共同的限速分子。研究表明,SRC-1主要表达在神经细胞系的成熟神经元[6],与神经元突触可塑性有关[7-10],在与学习记忆有关的脑区,如海马、嗅球、杏仁核和小脑浦肯野细胞等,SRC-1蛋白呈现高表达且表达量随脑老化显著性下降[11],因此,SRC-1在NSCs分化过程中的作用值得探索。本实验目的是明确SRC-1基因在NSCs体外培养分化过程中表达的变化,为后期研究打下基础。
1 材料与方法 1.1 动物新生昆明(Kunming mice,KM)种小鼠(SPF级,1~3 d),购自湖北省疾病预防控制中心下属的实验动物研究中心,批号:42000600026758。
1.2 主要仪器CO2恒温培养箱(日本SANYO公司);PCR仪(东胜创新生物科技有限公司);实时荧光定量PCR仪(美国ABI);微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司);水平电泳仪、紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司);酶标仪(美国Thermo);显微镜(日本Olympus)。
1.3 主要试剂小鼠神经干细胞完全培养基(上海盖宁生物科技有限公司,GN-M0129);胎牛血清(美国Gemini公司,900-108);浓缩型正常山羊血清(封闭)、荧光(Cy3)标记羊抗小鼠IgG、荧光(FITC)标记羊抗小鼠IgG、β-actin小鼠单克隆抗体、HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司,货号分别为AR1009、BA1031、BA1101、BM0627、BA1051、BA1054;Nestin小鼠单克隆抗体、β3 Tubulin兔单克隆抗体(英国abcam公司,货号分别为ab6142、ab52623);GFAP(GA5)小鼠单克隆抗体(美国Cell Signaling公司,3670T);NCOA1小鼠单克隆抗体(美国sigma公司,SAB2702164);4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino-2-phenylindole,DAPI,碧云天,C1002);Trizol(美国Ambion公司,15596-026);DL2000 DNA Marker(德国TIANGEN公司,MD114-02);引物合成(杭州擎科生物科技有限公司)等。
1.4 小鼠原代(P0)NSCs体外培养和鉴定 1.4.1 培养取新生小鼠,浸入75 %乙醇烧杯致死;移至超净工作台内,俯卧固定小鼠,剪开头部皮肤,开颅取出大脑,分离大脑皮质组织,将组织剪碎成1 mm3碎块,放入含双抗PBS中。PBS清洗组织后加入消化液,37 ℃水浴摇床消化10 min后,加入FBS终止胰酶反应,吸管轻轻吹打至液体中无成块组织。组织悬液经细胞筛过滤,滤液经3 000 r·min-1离心后弃上清。用PBS重悬沉淀,经1 000 r·min-1离心再弃上清,保留细胞沉淀。用小鼠神经干细胞完全培养基重悬细胞,接种于培养皿中,于37 ℃、5% CO2恒温培养箱静置培养,24 h后收集未贴壁细胞,1 000 r·min-1离心后换液,以后每3天半量换液1次。细胞的密度达到70 %时进行传代:收集细胞悬液,1 000 r·min-1离心后弃去培养基,胰酶消化细胞制成单细胞悬液,按1 :2的比例传代,37 ℃、5 % CO2饱和湿度条件下在恒温培养箱静置扩大培养。
1.4.2 鉴定倒置相差显微镜下观察原代P0和第一代(P1)神经球培养2、4、6 d细胞生长情况并进行形态学鉴定。取培养d 7的P1细胞,用NSCs特异性标记物巢蛋白Nestin,通过细胞免疫荧光单标化学法鉴定。
1.4.3 细胞免疫荧光单标化学方法培养的NSCs是悬浮状态,吸尽培养液,1 000 r·min-1离心3 min收集细胞,弃上清,PBS浸洗3 min×2次,用4 %的多聚甲醛固定、PBS浸洗后,用PBS稀释至合适浓度,滴于载玻片,放入37 ℃烘箱烘干。用0.5 % Triton X-100室温通透细胞后,PBS再漂洗玻片。吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清封闭液30 min;吸水纸吸干但不洗,每张玻片滴加足量Nestin小鼠单克隆抗体(1 :50)并放入湿盒,4 ℃孵育过夜后用PBST浸洗。吸水纸吸干爬片多余液体后滴加二抗荧光(Cy3)标记羊抗小鼠IgG(1 :100),湿盒35 ℃孵育1 h后PBS漂洗。在暗处滴加DAPI避光孵育5 min后用PBS漂洗。在暗处用吸水纸吸干爬片液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。荧光显微镜下观察采集图像。PBS取代一抗做阴性对照,其余步骤同。
1.5 评价小鼠NSCs的多潜能分化 1.5.1 分化诱导用含10%胎牛血清小鼠NSCs完全培养基作为分化培养基。准备12孔板一板,用消毒后的单张爬片放入12孔板,加0.1 %多聚赖氨酸过夜包被,用PBS浸洗。取生长状态良好的细胞,胰酶消化后用分化培养基重悬,制成单细胞悬液。按5×105个/孔加入预先包被多聚赖氨酸爬片的孔中,37 ℃,5 % CO2培养箱培养。NSCs主要分化成神经元、星形胶质细胞[12],取诱导分化d 3、9的细胞,进行细胞免疫荧光双标实验,荧光显微镜鉴定NSCs分化的细胞类型(神经元和星形胶质细胞)。
1.5.2 细胞免疫荧光双标化学方法方法同1.4.3,只是一抗用β3 Tubulin兔单克隆抗体(1 :100)标记神经元,二抗用荧光(Cy3)标记羊抗兔IgG(1 :100),湿盒35 ℃孵育1 h,PBST浸洗后用山羊血清封闭30 min,再加一抗GFAP小鼠单克隆抗体(1 :100)标记星形胶质细胞,对应的二抗用荧光(FITC)标记羊抗小鼠IgG(1 :100),随后用DAPI染核。
1.6 小鼠SRC-1基因在NSCs分化过程的表达取NSCs分化d 0、3、9细胞为观察对象。
1.6.1 SRC-1基因mRNA表达用定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)技术检测。Trizol法提取细胞RNA,逆转录获cDNA,做实时荧光定量PCR检测各样本的Ct值。由溶解曲线判断PCR反应的特异性,用2-△△Ct方法计算目的基因的相对表达量。以NSC诱导分化d 0细胞组为对照,其余各组为实验组,△△Ct = △Ct (实验组) - △Ct (对照组),△Ct = Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。每组n=3,每样本做3复孔。β-actin为内参。引物序列:β-actin上游5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′,下游5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。小鼠SRC-1上游5′-CCCCTCAGACATCACCACTT-3′,下游5′-ACCTTTACGTCATCCAGGCA-3′。数据采用仪器自带软件分析。
1.6.2 SRC-1基因的蛋白表达用免疫印迹(Western blot)法做半定量分析。每时间段n=3。收集细胞用细胞裂解液抽提蛋白,在说明书指导下分别进行蛋白定量,随后行凝胶电泳、转膜、封闭。免疫反应中一抗分别用NCOA1小鼠单克隆抗体(工作浓度1 :500),对照用β-actin小鼠单克隆抗体(工作浓度1 :200)。与HRP标记羊抗小鼠二抗杂交、洗膜等操作后,将膜与化学发光底物室温孵育,曝光胶片,显影定影。用BandScan分析胶片灰度值。以SRC-1目的条带与内参β-actin条带灰度值比值代表各时间点SRC-1蛋白的相对表达量,再用此数值进行样品间的比较和分析。
1.7 统计学处理数据均以平均值±标准差(x±s)表示,组间数据使用独立样本t-test统计学方法分析,用SPSS19.0统计软件包进行。
2 结果 2.1 小鼠NSCs原代和传代培养分离新生小鼠大脑皮质,将其消化为单细胞体外培养。显微镜下观察2、4、6 d细胞生长情况。原代NSCs(Fig 1A~C),细胞悬浮生长,在镜下呈大小不一的神经球。由于神经球是由单细胞增殖分裂而成,在培养过程中细胞有丝分裂,细胞数量增多,神经球渐变大,在d 6直径超100 μmol·L-1。P1代(Fig 1D~F)相较原代细胞,在d 6形成的神经球大部分比原代神经球小,但神经球形状更规则。
2.2 Nestin鉴定NSCsNestin是NSCs的特异性标记物,细胞免疫荧光单标实验结果(Fig 2),荧光显微镜下观察到传代神经球Nestin抗原阳性,呈红色(Fig 2A),DAPI染色的细胞核呈蓝色(Fig 2B),说明传代神经球是由NSCs组成。阴性对照组PBS取代一抗Nestin小鼠单克隆抗体,不显色(Fig 2D),DAPI染色的细胞核呈蓝色(Fig 2E)。两者合成(Fig 2F)。
2.3 检测NSC分化后的细胞类型取NSCs分化d 3、9的细胞,进行细胞免疫荧光双标实验。荧光显微镜下被β3 Tubulin兔单克隆抗体标记的细胞呈红色,为神经元;被GFAP小鼠单克隆抗体标记的细胞呈绿色,为星形胶质细胞;细胞核被DAPI染成蓝色。实验结果如Fig 3。
NSCs分化d 3,细胞以神经元为主,胞体以圆形、椭圆形和不规则形为主;分化d 9,以胞体具有较多突起,突起交互呈网状的星形胶质细胞为主。
2.4 小鼠SRC-1基因在NSCs及其分化过程的表达 2.4.1 SRC-1基因mRNA表达RT-qPCR检测,结果(Fig 4A)显示,与NSCs分化诱导d 0(1.032±0.117)比较,SRC-1基因mRNA相对表达量在NSCs分化d 3(5.228±0.803)明显升高(P<0.01),d 9(0.529±0.116)明显降低(P<0.01),说明SRC-1基因主要表达在NSCs分化前期。
2.4.2 SRC-1基因的蛋白表达Western blot检测显示(Fig 4B),与NSCs分化d 0的SRC/β-actin蛋白量比值(0.292±0.067)相比,NSCs分化d 3(0.839±0.072)明显升高(P < 0.01),d 9(0.167±0.028)明显下降(P < 0.05),说明SRC-1基因主要表达在NSCs分化前期。
3 讨论研究表明,SRC-1在啮齿动物脑内广泛的表达,在学习记忆关键的脑区海马组织,SRC-1的表达与某些突触蛋白,如突触囊泡素(synaptophysin, SYN)、谷氨酸盐受体(Glutamate receptor-1, GluR-1)、突触后致密物(postsynaptic density-95, PSD-95)的发育模式高度一致[7-8]。小鼠SRC-1基因敲除显示小鼠的小脑SYN表达明显延迟,出现基于小脑的技巧性学习能力障碍[9]。若体外抑制原代海马神经元SRC-1的表达,神经元突起减少、变短,突起之间的联系和接触减少[10]。上述研究均提示,SRC-1的表达可能与神经元突触可塑性有关。研究还表明,SRC-1是主要表达在神经细胞系的成熟神经元[6],因此,我们推测SRC-1基因在神经元发育中可能起一定作用,对NSCs诱导分化为神经元可能产生一定影响。因此,本实验目的是先明确SRC-1基因在NSCs分化过程的表达情况。
实验结果表明,用新生小鼠大脑皮质组织获取NSCs原代细胞,在小鼠神经干细胞完全培养基下培养,悬浮生长,用NSCs的特异性标记物巢蛋白Nestin做鉴定,证明培养的细胞是NSCs。由于NSCs主要分化为神经细胞、星形胶质细胞,分化为少突胶质细胞的比例极少[12-13],因此本实验在血清分化培养基诱导NSCs贴壁并分化后,用β3 Tubulin抗体标记神经元,用GFAP抗体标记星形胶质细胞,通过细胞免疫荧光双标实验,证实NSCs被诱导3 d和9 d后,可以分化为神经元和星形胶质细胞,具有多潜能分化功能,且在分化d 3,细胞类型主要为神经元,在分化d 9,细胞类型主要为神经胶质细胞。研究显示[12], 在NSCs分化过程,分化前期主要是神经元,分化后期参与分化的NSCs数量增多,细胞类型以星形胶质细胞为主。如在分化时间3~7 d,神经元数量先增多后减少,星形胶质细胞数目呈明显增长趋势,其他未标记细胞数由多变小。该研究结果表明可能存在如下情况:神经元在细胞体外混合培养,培养条件控制不好易死亡,而神经胶质细胞增殖快。本实验结果与上述研究符合。
在实验中,与NSCs分化d 0相比,SRC-1基因mRNA和蛋白的表达量在分化d 3明显升高(P < 0.01),在分化d 9明显下降(P < 0.05)。结合实验NSCs在分化d 3、9的主要细胞类型,我们认为在NSCs分化过程中,SRC-1基因的表达量有显著变化,表达分布依次为神经元>NSCs>星形胶质细胞。但SRC-1基因是否能促进NSCs分化为神经元,还需进一步实验研究。
( 致谢: 本实验是在福建医科大学基础医学院脑老化与神经变性疾病重点实验室完成,感谢给予指导以及参与实验的张阳、高美钦、陈小鹰、王志红教师以及鲁萌萌、孙维珊学生的帮助。)
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