2. 江南大学国家功能食品工程技术研究中心, 江苏 无锡 214122;
3. 江南大学无锡医学院, 江苏 无锡 214122
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi Jiangsu 214122, China;
3. Wuxi School of Medicine, Jiangnan University, Wuxi Jiangsu 214122, China
高血压是心脑血管的主要危险因素, 是导致我国居民死亡的主要原因之一[1-2]。高血压的发生和发展受遗传因素和环境因素的共同影响[3], 而在近年来的研究中, 造成高血压的主要因素60%与代谢异常有关, 约80%的高血压患者存在各种形式的代谢紊乱[4]。
代谢组学使用定量分析和生物信息学方法, 检测生物样本中的代谢物组成和含量变化, 推断与疾病的发展和治疗相关的特征性代谢产物[5]。其灵敏度高, 可以检测疾病早期小分子代谢物的变化[6]。本研究通过N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methylester, L-NAME)诱导高血压模型小鼠, 使用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)对高血压模型小鼠与对照小鼠的血清标本进行检测, 寻找高血压病变的差异代谢产物。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物野生型C57BL6/J小鼠, ♂, 平均体质量约23 g, 南京大学模式动物研究所提供, 许可证编号:SYXK(苏)2016-0012。
1.1.2 试剂与仪器L-NAME(美国Sigma公司)。小鼠无创血压仪(美国IITC); 液相色谱2777C UPLC system、质谱Xevo G2-XS QTOF(Waters公司)。
1.2 方法 1.2.1 L-NAME高血压模型小鼠的构建饮用添加L-NAME含量为0.5 g·L-1的无菌水, 诱导小鼠血压升高, 对照组饮用正常无菌水。每天监测小鼠血压变化, 连续监测4周。
1.2.2 样本采集小鼠眼眶取血, 室温静置2 h, 4 ℃、1 500×g离心20 min, 取上清。
1.2.3 样本预处理40 μL样品的EP管中加入甲醇120 μL, 封口后震荡1 min, 室温静置10 min, 置于-20 ℃过夜; 次日4 000×g、4 ℃离心30 min, 取上清。
1.2.4 UPLC-QTOF/MS分析条件采用超高效液相色谱进行色谱分离, 色谱柱柱温为50 ℃, 流速为0.4 mL·min-1, 其中A流动相为水和0.1%甲酸, B流动相为甲醇和0.1%甲酸。对代谢物进行梯度洗脱。每个样本的上样体积为10 μL。
对从色谱柱上洗脱下来的小分子, 利用高分辨串联质谱Xevo G2-XS QTOF分别进行正负离子模式采集。采用MSE模式进行centroid数据采集, 一级扫描范围为50~1 200 u, 扫描时间为0.2 s, 对所有母离子按照20~40 eV的能量进行碎裂, 采集所有的碎片信息, 扫描时间为0.2 s。
1.2.5 统计学处理质谱数据处理, 峰提取主要通过软件Progenesis QI(version 2.2)实现。代谢组学R软件包metaX对质谱数据进行统计分析。实验数据以x±s表示, 统计学差异分析采用GraphPad Prism进行t检验分析。
2 结果 2.1 动物模型构建与血压变化尾套法测小鼠血压, 高血压模型构建成功, L-NAME组的血压较对照组血压有明显的升高(P<0.01)。见Tab 1。
Group | Systolic blood pressure/mmHg | ||
0 d | 10 d | 20 d | |
Control | 89.25±1.27 | 91.67±1.58 | 90.83±2.08 |
L-NAME | 87.85±1.03 | 117.85±1.61** | 133.70±1.79** |
**P<0.01 vs control |
分析显示, L-NAME组与对照组正离子模式和负离子模式下均存在差异, 说明高血压组的血清中组分发生了改变。
2.3 偏最小二乘判别分析L-NAME组与对照组分析结果显示, 正离子模式下, R2=0.9807, Q2=0.6623;负离子模式下, R2=0.971 1, Q2=0.822 5。分析结果显示, 该PLSDA模型的解释能力和预测能力较好。
2.4 差异性代谢物筛选筛选差异表达的代谢物满足条件:多变量分析PLS-DA模型前两个主成分的VIP值≥ 1;单变量分析fold change≥1.2或者≤0.833 3;q-value<0.05。得到同时满足3个条件的离子即差异离子。筛选出差异相对明显的10个化合物, 见Tab 2。
No | Potential biomarker | Formula | L-NAME group Change Trenda | VIP | Fold change | q-value |
1 | Nonadecanoic acid | C19H38O2 | ↓ | 2.78 | 0.45 | 0.003 7 |
2 | Tuberculostearic acid | C19H38O2 | ↓ | 2.07 | 0.56 | 0.009 1 |
3 | 4-Sulfobenzyl alcohol | C7H8O4S | ↑ | 4.31 | 5.22 | 0.005 3 |
4 | Imidazole-acetol phosphate | C6H9N2O5P | ↑ | 3.20 | 2.97 | 0.035 4 |
5 | 2-Carboxy-D-arabinitol 1-phosphate | C6H13O10P | ↑ | 6.06 | 6.21 | 0.011 2 |
6 | Eicosapentaenoic acid | C20H30O2 | ↓ | 3.23 | 0.27 | 0.000 2 |
7 | 20alpha-Hydroxyprogesterone | C21H32O2 | ↓ | 3.75 | 0.21 | 0.000 5 |
8 | Bitocholic acid | C24H40O5 | ↓ | 4.53 | 0.067 | 0.003 8 |
9 | 4-Hydroxybutanoic acid | C4H8O3 | ↑ | 2.33 | 2.01 | 0.002 1 |
10 | p-Cresol | C7H8O | ↑ | 3.56 | 4.00 | 0.023 2 |
aTrends of L-NAME group with control group of metabolites.(↑):up-regulated; (↓): down-regulated. |
L-NAME是NO合酶抑制剂, 可以抑制内源性NO的产生[7], 造成内皮功能障碍, 长期给予L-NAME可导致小鼠高血压。高血压小鼠血清代谢物成分发生改变, 与正常小鼠相比, 在正负离子模式下分别得到107和272个差异代谢物。发现十九烷酸等10种差异相对明显的代谢物, 可能成为高血压发生的潜在生物标志物。值得注意的是, 在KEGG数据库中搜索了10种代谢物的可能匹配途径, 其主要涉及组氨酸代谢、丁酸代谢、碳代谢、TRP通道的炎症介质调节和蛋白质的消化吸收等。我们将进一步深入研究对应化合物造成高血压的具体机制, 为高血压的预防、诊断与治疗提供初步参考数据。
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