糖尿病是指胰岛素绝对或者相对不足所导致糖代谢紊乱为主的全身性疾病, 同时引发脂代谢以及蛋白代谢异常, 从而导致机体内环境紊乱, 继而引发组织、器官以及系统病变的一种综合代谢疾病。糖尿病临床治疗较为棘手, 且尚缺乏特异性、针对性的治疗药物, 因此, 研究开发有效治疗糖尿病的药物, 是目前医药工作者共同努力的方向。
杨桃根(酢浆草科)作为一种极具地方特色的中草药, 是中国广西丰富的地道药用植物资源, 民间多将其用来抗高血糖, 治疗感冒头痛, 缓解胃病[1-2]。本课题组前期的药理研究表明：杨桃根总提取物及醇提取物能够降低糖尿病小鼠的血糖, 改善血脂代谢及提高抗氧化能力[3-5], 但杨桃根苯醌治疗糖尿病尚未有明确的研究。本研究将以尾静脉注射STZ建立糖尿病小鼠模型, 通过观察杨桃根苯醌(benzoquinone of Averrhoa carambola L.root, BACR)对糖尿病小鼠血脂, 氧化应激能力, 炎症因子及对TLR4/MyD88/NF-κB蛋白表达的影响, 初步探讨BACR对糖尿病小鼠治疗作用及其作用机制。
1 材料 1.1 动物KM ♂小鼠, SPF级, 体质量(20±2)g, 采购自广西医科大学实验动物中心。动物饲养于通风良好的环境中, 室温(18~25) ℃, 相对湿度40%~70%, 12 h光照昼夜循环, 实验动物生产许可证号为：SCXKG桂2014-0002, 实验动物使用许可证：XYKG桂2014-0003。
1.2 药材与试剂杨桃根苯醌提取物由本课题组自行制备[6]。盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司); 链脲佐菌素(STZ, 美国Sigma公司); 总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒, 均购于上海执诚生物科技股份有限公司; 单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒, 均购于上海源叶生物科技有限公司; 超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒, 均购于南京建成生物工程研究所; Toll样受体4因子(TLR4)抗体、髓样分化因子(MyD88)抗体、核转录因子-κB(NF-κB)抗体, 均购于Abcam公司。
1.3 仪器Accu-Chek Performa型血糖仪(德国罗氏诊断有限公司); 5810R高速低温离心机(艾本德中国有限公司); 日立7100型全自动生化分析仪; BX53正置显微镜(日本奥林巴斯公司); SpectraMaxPius384连续光谱扫描式酶标仪(香港分子仪器公司)
2 方法 2.1 糖尿病小鼠模型的建立及分组给药实验小鼠适应性饲养3 d后, 造模前禁食不禁水12 h, 随机选取10只健康小鼠作为正常组, 其余小鼠均尾静脉注射STZ 320 mg·kg-1(STZ溶于生理盐水中, 现配现用, 冰浴保存)。72 h后进行尾静脉取血, 使用罗氏血糖仪测小鼠空腹血糖(FBG), 选取FBG≥11.1 mmol·L-1者作为糖尿病模型小鼠。将糖尿病小鼠随机分为模型组、二甲双胍组(320 mg·kg-1)、BACR高、中、低剂量组(120 mg·kg-1、60 mg·kg-1、30 mg·kg-1), 连续灌胃给药21 d, 正常组和模型组每天给予等量生理盐水灌胃。并分别于灌胃给药第0 d、7 d、14 d、21 d将小鼠禁食、不禁水12 h后称体质量, 将小鼠尾静脉取血, 测定小鼠空腹血糖。
2.2 指标测定 2.2.1 小鼠血清血脂及炎症因子指标检测末次给药后, 小鼠摘除眼球取血, 血液自然凝固后于离心机中3 500 r·min-1 4 ℃低温离心10 min, 分离上层血清, 全自动生化分析仪检测血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C、MCP-1、IL-1β炎症因子指标, 严格按照试剂盒说明进行检测。
2.2.2 肝脏组织指标的检测小鼠取材时摘取出肝脏洗去积血, 取适量的肝脏组织加入生理盐水制备成10%的肝组织匀浆, 离心后取上清用于SOD、MDA、GSH-Px的测定。
2.2.3 肝组织病理学检测及免疫组化法检测肝组织通过10%甲醛固定后, 常规石蜡包埋, 进行HE染色, 观察肝组织的病变及免疫组化染色检测TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表达。
2.3 统计学分析采用SPSS19.0统计学软件对数据进行分析, 数据结果以x±s表示, 多组间比较采用ONE-WAY ANOVA, 两两比较采用t检验。
3 结果 3.1 小鼠的一般指标给药21 d后, 正常组小鼠毛发光亮, 精神状态较好, 饮食饮水正常。模型组小鼠毛色灰暗, 反应迟钝, 多饮多食多尿, 体质量明显下降(P＜0.01), 垫料潮湿。其余给药组的小鼠精神状态较模型组有所改善, 能减轻多饮多食多尿的症状, 体质量较模型组有所增加, 差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见Tab 1。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Body weight/g | |||
| 0 | 7 d | 14 d | 21 d | ||
| Normal | - | 26.77±1.51 | 29.41±1.65 | 32.78±2.34 | 36.14±1.56 |
| Model | - | 27.68±1.54 | 23.45±2.58** | 22.24±2.07** | 20.47±1.95** |
| Metformin | 320 | 27.81±2.31 | 25.97±2.37**# | 24.63±2.57**# | 23.97±3.14**## |
| BACR | 120 | 27.43±1.47 | 26.20±2.46**# | 25.57±1.9**## | 24.89±2.16**## |
| 60 | 26.76±1.41 | 25.58±2.16** | 24.86±2.42**# | 23.70±2.59**## | |
| 30 | 27.79±2.72 | 24.97±2.78** | 23.07±2.28** | 22.57±2.11**# | |
| **P＜0.01 vs normal; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model | |||||
由Tab 2结果可知, 与正常组相比, 模型组小鼠的FBG明显升高(P＜0.01);灌胃给药21 d后, 与模型组比较, BACR高、中、低给药组小鼠的FBG明显降低(P＜0.01), 说明BACR对改善糖尿病小鼠的高糖状态具有一定的作用。
| Group | Dose/mg·kg-1 | FBG/mmol·L-1 | |||
| 0 | 7 d | 14 d | 21 d | ||
| Normal | - | 6.42±1.03 | 7.13±1.23 | 6.84±1.11 | 7.31±1.44 |
| Model | - | 18.94±2.08** | 20.06±2.09** | 22.73±3.38** | 20.47±1.95 |
| Metformin | 320 | 19.67±3.71** | 17.92±3.00**# | 15.67±1.96**## | 14.29±3.02**## |
| BACR | 120 | 18.89±3.48** | 17.94±3.60**# | 16.90±3.05**## | 14.58±3.18**## |
| 60 | 19.00±3.67** | 18.79±3.60** | 18.16±3.00**## | 16.89±4.00**## | |
| 30 | 19.38±2.80** | 20.14±4.11** | 20.93±2.03**# | 20.07±3.54**## | |
| **P＜0.01 vs normal; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model | |||||
由Tab 3结果可知, 与正常组相比, 模型组的TC、TG、LDL-C明显升高(P＜0.01), HDL-C明显降低(P＜0.01);与模型组比较, BACR 3个剂量组小鼠的TC、TG明显降低(P＜0.05或P＜0.01), HDL-C明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。BACR高剂量组LDL-C降低, 差异有统计学意义(P＜0.05), BACR中、低剂量组LDL-C也一定的降低, 但差异无统计学意义(P>0.05)。
| Group | Dose/mg·kg-1 | TC/mmol·L-1 | TG/mmol·L-1 | LDL-C/mmol·L-1 | HDL-C/mmol·L-1 |
| Normal | - | 2.18±0.39 | 1.00±0.11 | 0.21±0.10 | 3.63±0.37 |
| Model | - | 5.04±0.98** | 1.85±0.23** | 0.60±0.28** | 2.51±0.52** |
| Metformin | 320 | 3.23±0.70**## | 1.38±0.29**## | 0.25±0.20# | 3.31±0.38## |
| BACR | 120 | 3.15±0.62**## | 1.35±0.22**## | 0.29±0.13# | 3.24±0.42## |
| 60 | 3.45±0.72**## | 1.47±0.33**# | 0.34±0.22 | 2.93±0.51**# | |
| 30 | 4.29±0.85** | 1.69±0.19** | 0.47±0.31 | 2.49±0.41** | |
| **P＜0.01 vs normal; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model | |||||
由Tab 4结果可知, 与正常组相比, 模型组小鼠的SOD、GSH-Px活性明显降低(P＜0.01), MDA水平明显升高(P＜0.01);与模型组小鼠比较, BACR可以明显增高小鼠肝脏SOD、GSH-Px活力, 明显降低MDA含量(P＜0.05或P＜0.01), BACR低剂量组的SOD虽然有所升高, 也降低了MDA水平, 但差异均无统计学意义(P>0.05)。
| Group | Dose/mg·kg-1 | SOD/kU·g-1 Pro | MAD/μmol·g-1 Pro | GSH-Px/kU·g-1 Pro |
| Normal | - | 121.58±10.66 | 1.23±0.16 | 622.77±56.97 |
| Model | - | 86.92±11.08** | 1.79±0.30** | 448.02±27.54** |
| Metformin | 320 | 110.54±13.73## | 1.36±0.24## | 582.89±40.83## |
| BACR | 120 | 114.58±18.60## | 1.38±0.28## | 571.04±48.15## |
| 60 | 105.76±12.70**## | 1.43±0.26**## | 527.17±56.83**## | |
| 30 | 94.76±10.05** | 1.66±0.31** | 495.41±36.27**# | |
| **P＜0.01 vs normal; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model | ||||
由Tab 5结果可知, 与正常组相比, 模型组小鼠的MCP-1、IL-1β含量明显升高(P＜0.01)。与模型组比较, BACR高、中剂量组小鼠的MCP-1、IL-1β含量明显降低, 差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。BACR低剂量组小鼠IL-1β含量有一定下降, 但差异无统计学意义(P>0.05)。
| Group | Dose/ mg·kg-1 |
IL-1β/ng·L-1 | MCP-1/ng·L-1 |
| Normal | - | 71.91±7.26 | 303.10±34.53 |
| Model | - | 91.10±9.36** | 447.86±52.51** |
| Metformin | 320 | 74.10±8.92## | 345.00±26.93d## |
| BACR | 120 | 75.52±8.45## | 384.29±29.69**## |
| 60 | 79.33±7.47# | 380.24±25.30**## | |
| 30 | 85.14±7.91** | 401.67±44.47**# | |
| **P＜0.01 vs normal; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model | |||
由Fig 1肝脏HE染色结果可知, 正常组小鼠肝细胞形态结构完整, 肝细胞索排列整齐, 无炎症细胞浸润。模型组小鼠肝细胞肿胀, 出现局部坏死, 肝索排列紊乱, 胞质中出现大小不一的脂滴, 与周围细胞连接不紧密。二甲双胍组及BACR 3个剂量组小鼠肝细胞形态结构较完整, 肝细胞数量增多, 肝索形状排列比较清晰, 明显减轻了肝细胞损伤, 改善了糖尿病引起的肝脏病变。
|
| Fig 1 Histological observations of liver tissues (HE staining×400) A: Normal; B: Model; C: Metformin; D: BACR high dose; E: BACR middle dose; F: BACR low dose |
由Fig 2及Tab 6肝脏免疫组化结果可知, 与正常组相比, 模型组小鼠肝脏组织TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表达明显上调(P＜0.01), 蛋白表达主要集中在细胞核及胞浆。与模型组相比, 各给药组可以明显下调小鼠肝脏组织TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表达水平(P＜0.05或P＜0.01)。
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| Fig 2 Effects of BACR on expressions of TLR4、MyD88、NF-κB in liver tissues of mice (×400) A: Normal; B: Model; C: Metformin; D: BACR high dose; E: BACR middle dose; F: BACR low dose |
| Group | Dose/ mg·kg-1 |
TLR4 IOD SUM×104 |
MyD88 IOD SUM×104 |
NF-κB IOD SUM×104 |
| Normal | - | 0.52±0.23 | 0.74±0.21 | 0.83±0.24 |
| Model | - | 7.15±1.05** | 11.23±0.73** | 11.65±0.53** |
| Metformin | 320 | 2.43±0.75*## | 3.35±1.18**## | 3.67±0.87**## |
| BACR | 120 | 2.31±0.84*## | 3.33±0.80**## | 3.93±1.26**## |
| 60 | 4.09±1.72**## | 7.51±0.26**## | 7.12±1.83**## | |
| 30 | 5.11±1.04**# | 9.61±0.40**## | 9.02±0.97**## | |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs normal; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model | ||||
STZ是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲, 是目前被公认的制备糖尿病小鼠模型的经典化学诱导剂, 它对小鼠的胰岛β细胞具有特异的毒性, 使细胞代谢的氧化机制遭到破坏, 导致胰岛β细胞坏死, 使机体内胰岛素分泌不足, 产生了高血糖, 进而引发了脂代谢和蛋白质代谢的紊乱[7-8]。本实验采用STZ特异性破坏小鼠胰岛β细胞, 使血糖升高, 造成血脂代谢紊乱其主要特点是TG升高HDL-C降低进而建立糖尿病小鼠模型, 其结果表明, 与模型组相比, 二甲双胍组及BACR给药组降低了FBG、TC、TG、LDL-C水平, 提高了HDL-C水平, 有效的调节了糖尿病小鼠体内的血脂代谢。研究发现, 氧化应激反应在糖尿病的发展起着重要作用, 在高糖情况下, 机体会产生过量的自由基导致机体损伤进而引发糖尿病的并发症[9]。肝脏机体代谢调节的过程中扮演重要角色, 同时也参与了氧化应激体系的调节, STZ诱导的糖尿病小鼠肝脏抗氧化能力下降明显, 会诱导氧化应激反应(SOD、MDA、GSH-Px)[10]。MDA是脂质过氧化反应的的中间产物之一, 是氧化应激损伤的重要标记物, 在STZ刺激下机体MDA的积累逐渐增多, 进一步损坏了细胞生物膜[11]。SOD和GSH-Px是机体的清除剂, 它们能特异性清除过氧自由基, 羟基自由基, 超氧阴离子[12]。作为脂质过氧化的防御系统, 减轻了活性氧的损伤。本实验结果表明, 给予BACR治疗后, 糖尿病小鼠肝脏的MDA含量明显下降, SOD和GSH-Px含量明显升高, 提示BACR能够增强机体的抗氧化能力有效减轻氧化应激损伤。
TLR4是Toll样家族的主要成员, 其主要通过TLR4依赖的MyD88通路介导炎症, 当机体中的炎症因子过度释放时, 导致TLR4受体活化[13-14]。MyD88是TLR4信号通路的主要接头蛋白, 也是NF-κB信号通路中枢转导蛋白。MCP-1趋化因子主要来源于单核巨噬细胞, 慢性炎症中有重要作用。IL-1β是最活跃的炎症因子之一, 通常被当作是炎症反应的生物标记物。STZ诱导产生的高血糖使机体MCP-1、IL-1β过度释放, 加快了炎症反应进程[15], NF-κB作为TLR4下游传导信号调控了MCP-1、IL-1β的转录, 抑制了TLR4/MyD88/NF-κB通路的表达可以抑制炎症反应的进行。本实验结果表明, 二甲双胍组和BACR给药组降低了MCP-1、IL-1β的水平, 下调了TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表达, 提示BACR对糖尿病的治疗作用可能与其参与抑制炎症因子有关。
综上所述, BACR能够改善糖尿病小鼠的血糖和血脂水平, 其机制可能与改善氧化应激能力, 减轻炎症反应及抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。
( 致谢: 实验在广西医科大学药学院中心实验室完成, 感谢老师和同学的协助 )
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