增强胃肠动力是治疗胃肠动力障碍性疾病的主要手段之一[1]。中药莪术具有改善胃动力、加强胃肠功能的作用[2]。前期的研究结果表明, 中药莪术的主要成分莪术醇(C15H24O2, curcumol)具有促进大鼠离体十二指肠平滑肌收缩活动作用[1, 3]。为进一步探讨莪术醇与空肠、回肠平滑肌收缩活动的关系, 明确莪术醇对小肠各段的作用, 本实验采用离体灌流的方法, 观察莪术醇对大鼠离体空肠、回肠平滑肌收缩功能的影响, 为胃肠动力障碍性疾病的药物筛选提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物健康成年Wistar大鼠, 体质量(200±20)g, ♀♂不限, 由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供, 许可证号：SCXK(甘)2015-0001。
1.2 试剂与仪器莪术醇(货号与规格：36236-10MG)、Tween-80(货号与规格：P1754-500 mL)购自Sigma公司。硫酸阿托品(天津金耀药业有限公司, 批号：12020382);盐酸异丙肾上腺素(上海禾丰制药有限公司, 批号：31021344)、盐酸维拉帕米(上海禾丰制药有限公司, 批号：31021343), 重酒石酸去甲肾上腺素(远大医药有限公司, 批号：42021301)。以Tween-80溶解莪术醇, 溶解后用双蒸水补足容积, 配成10 μmol·L-1母液备用, 实验时按所需浓度稀释。Krebs液及无钙Krebs液按文献配制[1]。
BL-420i信息化集成化信号采集与处理系统、HW-500超级恒温水浴和HV1403离体组织器官恒温灌流系统由成都泰盟生物有限公司提供。
1.3 方法 1.3.1 大鼠离体空肠、回肠平滑肌标本的制备大鼠禁食24 h, 颈椎脱臼致死, 切开腹部, 以盲肠与回肠交界处为起点剪取回肠约4 cm, 以距离盲肠10 cm左右为起点剪取空肠约10 cm。将剪好的肠管放于常温Krebs液中, 剥离肠系膜, 冲洗干净肠内容物, 将其剪成约2 cm左右的肠段。将肠段两端结扎, 一端固定于挂钩上, 置于灌流槽中; 另一端与张力换能器相连, 基础张力调节为1 g左右, 恒温(37±0.5)℃水浴, 以每秒1~2个气泡的速度持续通气, 使用BL-420i信息化集成化信号采集与处理系统记录收缩的振幅和张力。
1.3.2 实验步骤将空肠和回肠标本各随机分成5组(n=12)：莪术醇组、阿托品加莪术醇组、异丙肾上腺素加莪术醇组、去甲肾上腺素加莪术醇组、Ca2+与莪术醇组。
莪术醇组：待标本活动稳定后, 向灌流槽中依次加入不同剂量的莪术醇母液, 使灌流槽中莪术醇终浓度分别为1、5、10、50、100 nmol·L-1, 记录肠管收缩的变化。
阿托品加莪术醇组、异丙肾上腺素加莪术醇组、去甲肾上腺素加莪术醇组：标本收缩稳定后, 各组分别向灌流槽中加入阿托品1 μmol·L-1、异丙肾上腺素0.1 μmol·L-1、去甲肾上腺素0.1 μmol·L-1, 3min后, 加入莪术醇母液, 使灌流槽中莪术醇终浓度为100 nmol·L-1, 记录肠管收缩的变化。
Ca2+与莪术醇组：标本收缩稳定后, 更换灌流液为无钙Krebs液, 3 min后加入莪术醇母液, 使灌流槽中莪术醇终浓度为100 nmol·L-1, 3 min后加入CaCl2以恢复Krebs液中Ca2+的浓度, 3 min后加入维拉帕米0.1 μmol·L-1, 记录肠管收缩的变化。
1.3.3 统计学处理以给药前正常Krebs液中稳定收缩波的平均振幅、平均张力为100%作为对照值, 其余数据为与其相比所得的相对值。数据均以x±s表示, 采用SPSS 21.0分析软件进行数据分析, 组间数据比较采用单因素方差分析或t检验, 进一步组间比较选用LSD-t检验及Dunnett-t检验。
2 结果 2.1 不同剂量莪术醇对空肠和回肠平滑肌收缩的影响莪术醇可兴奋空肠和回肠平滑肌, 明显加强其收缩的振幅和张力(P＜0.05, P＜0.01)。100 nmol·L-1组加强空肠、回肠平滑肌收缩的作用明显高于1 nmol·L-1组(P＜0.05, P＜0.01)。50 nmol·L-1组增加回肠平滑肌收缩张力的作用明显高于1 nmol·L-1组(P＜0.05)。其余各剂量组间收缩振幅、张力差异无显著性(Fig 1, 2)。
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| Fig 1 Effects of different concentrations of curcumol on contractile amplitude of isolated jejunal and ileal smooth muscles (x±s, n=12) **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs 1 nmol·L-1 curcumol group |
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| Fig 2 Effects of different concentrations of curcumol on contractile tension of isolated jejunal and ileal smooth muscles (x±s, n=12) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs 1 nmol·L-1 curcumol group |
阿托品可松弛空肠和回肠平滑肌, 明显降低收缩的振幅和张力(P＜0.01)。应用莪术醇后, 明显促进了因阿托品作用而松弛的空肠和回肠平滑肌的收缩(P＜0.01), 但收缩振幅和张力仍明显低于对照组(P＜0.01)(Fig 3)。
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| Fig 3 Curcumol antagonized relaxation of smooth muscles induced by atropine (x±s, n=12) **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs atropine group |
异丙肾上腺素可松弛空肠和回肠平滑肌, 明显降低收缩的振幅和张力(P＜0.05, P＜0.01)。应用莪术醇后, 对异丙肾上腺素松弛空肠和回肠平滑肌的作用均无明显改善(Fig 4)。
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| Fig 4 Isoproterenol antagonized excitatory effect of curcumol on smooth muscle contraction (x±s, n=12) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group |
去甲肾上腺素可松弛空肠和回肠平滑肌, 明显降低收缩的振幅和张力(P＜0.01)。应用莪术醇后, 明显促进了因去甲肾上腺素作用而松弛的空肠和回肠平滑肌的收缩, 收缩的振幅及张力明显增大(P＜0.05), 但空肠平滑肌的收缩振幅、回肠平滑肌的收缩振幅和张力仍明显低于对照组(P＜0.01, P＜0.05), 见Fig 5。
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| Fig 5 Curcumol antagonized relaxation of smooth muscles induced by norepinephrine (x±s, n=12) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs norepinephrine group |
在无钙Krebs液中, 离体空肠和回肠平滑肌的收缩明显减弱(P＜0.01)。应用莪术醇后, 空肠、回肠平滑肌收缩的振幅和张力无明显变化, 仍明显低于对照组(P＜0.01)。加入CaCl2恢复Krebs液中Ca2+浓度后, 空肠、回肠平滑肌收缩的振幅和张力增加, 明显高于对照组(P＜0.01)。应用维拉帕米后, 空肠和回肠平滑肌松弛, 收缩的振幅和张力明显降低(P＜0.05, P＜0.01)(Fig 6)。
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| Fig 6 Influence of Ca2+ on curcumol (x±s, n=12) 1.Calcium-free Krebs solution; 2.Curcumol; 3.CaCl2; 4.Verapamil.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs CaCl2 group |
胃肠道平滑肌的运动是消化系统最重要的功能之一, 是实现机械消化的基础。临床上胃肠运动功能障碍性疾病非常多见[4], 胃肠道运动功能紊乱是导致该病的一个主要原因[5]。利用中药调节胃肠动力、治疗胃肠动力障碍疾病, 疗效确切, 不良反应小, 临床应用广泛, 越来越受到更多的关注[6]。
莪术醇是莪术的主要成分之一。前期研究发现, 莪术醇对大鼠离体十二指肠的收缩具有促进作用, 此作用可能是通过兴奋M受体、抑制α和β肾上腺素能受体、促进外钙内流等途径实现[1]。本研究的结果进一步表明, 莪术醇对大鼠离体空肠、回肠平滑肌的收缩同样具有促进作用。故此可以推断, 莪术醇对大鼠离体小肠各段平滑肌的收缩均具有促进作用。
Ach作用于平滑肌M受体可引起外Ca2+内流, 导致平滑肌收缩, 阻断M受体可松弛小肠平滑肌[7]。激动β肾上腺素能受体, 可降低胞质Ca2+浓度, 松弛平滑肌[8]。激动α肾上腺素能受体, 不易形成动作电位, 可降低平滑肌收缩的兴奋性[2]。本实验结果表明, 阻断M受体、激动α受体和β受体均可松弛空肠、回肠平滑肌。与莪术醇联合应用后, 莪术醇表现出对抗阿托品、去甲肾上腺素松弛肠道平滑肌的作用, 提示莪术醇促进收缩的作用可能通过M受体和α受体起效; 异丙肾上腺素可拮抗莪术醇的作用, 提示莪术醇促进小肠运动的作用可能与抑制β受体有关。
平滑肌的兴奋-收缩耦联需要Ca2+作为耦联因子, 而胞质中Ca2+浓度的升高需要外钙内流和内钙释放两个环节的共同参与[9]。本实验结果表明, 莪术醇对无钙Krebs液中空肠、回肠平滑肌的收缩并无明显改善作用, 对正常Krebs液中肠管收缩的兴奋作用也可被钙通道阻断剂维拉帕米所抑制, 提示莪术醇促进空肠、回肠平滑肌的收缩主要依赖于细胞外液中钙离子的内流, 而对内钙释放的促进作用可能并不明显。
综上所述, 莪术醇对大鼠离体小肠各段即十二指肠、空肠、回肠平滑肌的收缩均具有促进作用, 这种作用可能通过兴奋M受体、抑制α和β肾上腺素能受体、促进外钙内流等途径实现。
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