2. 河北医科大学基础医学院病理学教研室，河北 石家庄 050017
2. Dept of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
系膜细胞增殖及细胞外基质增生是肾小球疾病进展的主要原因，目前血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)与增殖性肾炎发病的关系已经被广泛证实[1-2]。新近的研究显示，在血管平滑肌细胞中，PDGF可以诱导periostin表达[3]，而细胞间基质蛋白periostin与细胞增殖关系密切[4]，并在细胞外基质代谢中发挥重要作用[5]。PDGF促进系膜细胞增殖及细胞外基质增生的作用是否通过periostin起作用，目前未见报道。
本研究以小鼠系膜细胞(mouse mesangial cell，MMC)为研究对象，PDGF为刺激物，以增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)作为细胞的增殖指标，以纤连蛋白(fibronectin，FN)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作为细胞外基质合成的指标，通过观察PDGF刺激下periostin的表达及其与系膜细胞增殖、细胞外基质合成的关系，并构建periostin沉默质粒转染至小鼠系膜细胞内，观察转染periostin沉默质粒能否起到干预作用，为肾小球疾病进展的病因研究和靶向治疗提供新的思路。
1 材料 1.1 细胞株MMC购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。
1.2 试剂兔抗periostin多克隆抗体(ab152099)，购自英国Abcam公司；兔抗FN多克隆抗体(15613-1-AP)、兔抗PCNA多克隆抗体(10205-2-AP)、TRITC-猴抗兔IgG，均购自美国Proteintech公司；兔抗TGF-β1多克隆抗体、兔抗β-actin单克隆抗体，均购自美国Epitomics公司，pYr-adshuttle-4empty vector、pYr-ads-4-POSTON vector，购自长沙赢润生物有限公司；重组鼠PDGF-BB(315-18)，购自美国PeproTech公司。
1.3 仪器高速低温离心机(德国Eppendorf公司)；相差倒置显微镜、荧光显微镜(日本Olympus公司)；CO2培养箱(日本SANYO公司)。
2 方法 2.1 MMC细胞培养与实验分组用含10%胎牛血清的DMEM/F12(3：1)培养基常规培养小鼠系膜细胞。①细胞以6孔板培养24 h后，换含10 μg·L-1 PDGF刺激物的培养基，孵育细胞0、2、4、6、12 h，收集细胞进行免疫荧光化学染色和细胞总蛋白提取。② Lipofectamine 2000分别转染pYr-ads-4-POSTON vector及pYr-adshuttle-4empty vector空质粒，转染后的细胞进行G418(800 mg·L-1)抗性筛选，传代培养筛选出阳性克隆细胞。同步化后的细胞随机分为control组、PDGF组、PDGF+空质粒转染(PDGF+sh-nc)组和PDGF+ periostin沉默质粒(PDGF+sh-periostin)组。后3组细胞以10 μg·L-1 PDGF孵育6 h后终止培养，收集细胞，分别提取细胞总蛋白，进行免疫荧光化学染色。
2.2 Western blot检测蛋白表达收集各组细胞并加入冰冷的裂解液200 μL，提取总蛋白。采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，分装后-80 ℃保存。50 μg蛋白样品，加入加样缓冲液，沸水变性5 min，10% SDS-PAGE凝胶电泳湿转至PVDF膜；5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h；5%脱脂奶粉稀释一抗，periostin、PCNA、FN、TGF-β1及β-actin抗体(稀释比例1：1 000)4 ℃过夜。TBST洗膜后，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1：5 000稀释)，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜，滴加ECL增强化学发光试剂，Odyssey FC成像系统显像。用美国UVP公司LabWorks 4.5软件对条带进行分析，读取积分光密度值(integrated option density，IOD)，目的蛋白条带的IOD值除以β-actin条带的IOD值，进行统计学分析。
2.3 荧光细胞化学检测细胞采用6孔板爬片，培养终止后，细胞用4 ℃生理盐水冲洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS冲洗3次，每次5 min；0.5% Triton X-100 37 ℃打孔10 min，PBS冲洗，每次5 min，共3次；正常山羊血清封闭，37 ℃孵育1 h；弃封闭液，滴加1：200稀释的periostin一抗，4 ℃过夜；PBS冲洗，每次5 min，共3次; 滴加TRITC标记猴抗兔IgG，37 ℃孵育1 h；PBS冲洗，每次5 min，共5次; 滴加DAPI(1：100配制)，37 ℃孵育10 min；PBS冲洗，每次5 min，共5次；荧光显微镜下观察并摄取图像。
2.4 统计学分析计量资料以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行分析，组间比较采用方差分析。
3 结果 3.1 PDGF诱导periostin蛋白高表达10 μg·L-1 PDGF刺激MMC后，periostin蛋白表达明显升高。Fig 1的Western blot结果显示，刺激2 h后periostin水平开始升高，6 h达到高峰，表达上调2.69倍，12 h明显回落。同样Fig 2的细胞免疫荧光结果显示，PDGF刺激后periostin的表达明显增强，主要定位在胞质，而在0 h组，periostin仅在胞质有微弱表达。
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| Fig 1 1 Expression of periostin and PCNA protein in MMC stimulated by PDGF detected by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05 vs 0 h group |
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| Fig 2 Expression of periostin protein in MMC stimulated by PDGF detected by immunofluorescence (scale bar: 50 μm) Blue: DAPI staining. |
10 μg·L-1 PDGF刺激MMC后，PCNA蛋白表达明显升高，Fig 1的Western blot结果显示，刺激2 h后PCNA开始升高，6 h达到高峰，表达上调2.31倍，12 h明显回落。Fig 3结果显示，PDGF刺激后，FN、TGF-β1蛋白的表达明显上调，刺激4 h后，FN、TGF-β1蛋白的表达明显增加，6 h达高峰，分别较0 h组升高2.31、2.50倍。
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| Fig 3 Expression of FN, TGF-β1 protein in MMC stimulated by PDGF detected by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05 vs 0 h group |
质粒转染后，Fig 4的Western blot结果显示，与PDGF刺激的未转染组和转染空质粒组比较，转染sh-periostin沉默质粒(pYr-ads-4-POSTON vector)使periostin的蛋白表达明显下降，较空质粒组下降60.40%。同样Fig 5细胞免疫荧光结果显示，与转染空质粒组比较，转染sh-periostin沉默质粒组periostin蛋白的胞质表达明显减少。Western blot进一步检测了质粒转染并给予PDGF刺激后PCNA的蛋白表达，结果PCNA表达明显下降，较空质粒组降低47.74%(Fig 6)。
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| Fig 4 Expression of periostin protein in transfected sh-periostin vector MMC stimulated by PDGF detected by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs PDGF+sh-nc group |
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| Fig 5 Expression of periostin protein in transfected sh-periostin vector MMC stimulated by PDGF detected by immunofluorescence (scale bar: 100 μm) A:Control; B: PDGF; C: PDGF+sh-nc; D: PDGF+sh-periostin. Blue: DAPI staining. |
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| Fig 6 Expression of PCNA protein in transfected sh-periostin vector MMC stimulated by PDGF detected by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs PDGF+sh-nc group |
Western blot进一步检测了质粒转染并给予PDGF刺激后FN和TGF-β1的蛋白表达。如Fig 7所示，与PDGF刺激的未转染组和转染空质粒组比较，FN、TGF-β1的蛋白表达明显降低，分别下降57.77%、50.41%。
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| Fig 7 Expression of FN, TGF-β1 protein in transfected sh-periostin vector MMC stimulated by PDGF detected by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs PDGF+sh-nc group |
PDGF作为目前已知多肽生长因子中最强的有丝分裂原，与多种细胞增殖密切相关[6-7]，其过度表达与肾脏疾病的关系已被大量的实验所证实。PDGF可以刺激系膜细胞及单核巨噬细胞增殖、转型，并进一步刺激细胞外基质的产生[1-2]。近来的研究显示，PDGF可以诱导periostin在血管平滑肌细胞中的表达[3]，在系膜细胞中，PDGF能否诱导periostin的表达少见研究。最近，periostin在肾脏疾病中的作用受到越来越多的关注，PDGF促进系膜细胞增殖及细胞外基质增生的作用是否与periostin有关，尚未见报道。本实验Western blot与免疫荧光的结果显示，PDGF上调periostin蛋白表达，同时使PCNA和FN、TGF-β1的蛋白表达明显升高，表明PDGF上调系膜细胞增殖和细胞外基质合成水平，可能与上调periostin蛋白表达有关。
Periostin是细胞间基质蛋白的一种[8]，是αvβ1、β3、β4和β5整合素的配体。大量研究显示，periostin与细胞增殖、分化、黏附等关系密切，periostin在多囊肾的囊壁上皮细胞过表达，能够促进囊壁上皮细胞增殖，periostin敲除鼠与periostin(+/+)鼠相比，肾细胞增殖减轻，肾囊数目和总的囊面积减少，生存期明显延长[9]。periostin在细胞外基质的代谢中也发挥重要作用，与多种组织纤维化有关[10-11]。肾小管上皮细胞给予periostin刺激后，Ⅰ型胶原表达增加[12]。野生型单侧输尿管闭塞模型鼠梗阻侧肾脏periostin的表达、合成和肾损伤进行性增加，periostin敲除鼠则显示肾脏纤维化减轻，结构改善[13]。由缺氧或缺血引发的急性肾损伤小鼠，periostin通过p38 MAPK途径促进肾脏纤维化[14]。
为了进一步探讨PDGF引起的系膜细胞增殖和细胞外基质合成增加是否确实与上调periostin相关，我们转染了periostin沉默质粒，发现与PDGF刺激的未转染组和转染空质粒组比较，转染sh-periostin质粒组periostin的蛋白表达下降，同时PCNA、FN、TGF-β1蛋白表达明显减弱，提示periostin沉默质粒能够逆转PDGF引起的系膜细胞PCNA、FN、TGF-β1蛋白表达，PDGF引起的系膜细胞增殖和细胞外基质产生通过periostin起作用。
我们下一步的研究将在体外实验的基础上，将periostin沉默质粒转染至增殖性肾炎小鼠体内，从整体水平上探讨periostin在增殖性肾炎中的作用，为肾脏疾病进展的防治提供思路。
( 致谢: 本实验于河北医科大学病理学实验室完成，感谢实验室全体老师的帮助。)
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