2. 广西中医药大学第一附属医院药剂科，广西 南宁 530023
2. Dept of Pharmacy, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530023, China
肝纤维化是由慢性肝病引起的，与肝硬化高发病率和高死亡率密切相关。慢性氧化应激是启动肝脏纤维化过程的重要病因。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是内源性、肝脏特异性间充质细胞，在肝脏炎症和纤维化发生中起关键作用[1]。在正常肝脏中，HSC含有维生素A脂滴。通过肝损伤激活，静息HSC成为活化的HSC，其特征在于α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达，产生炎性细胞因子、趋化因子和细胞外基质蛋白(extracellular matrix，ECM)[2]。研究表明，氧化应激可以刺激HSC的活化，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)与HSC激活密切相关。ROS是由各种肝脏损伤产生的，如酒精滥用、肝炎病毒感染和慢性胆汁淤积，并有助于肝纤维化[3]。ROS可刺激胶原蛋白I的产生，是转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和Smad作用于肝纤维化的细胞内信号传导介质[4]。由于HSC在ECM形成中的重要作用，HSC的活化被认为是肝纤维化的重要部分。TGF-β1是引起ROS产生的主要细胞因子，可通过激活其下游Smad信号通路，刺激HSC的激活和增殖[5]。因此，TGF-β1/Smad信号被认为是预防和治疗肝纤维化的潜在靶标。
白花丹(Plumbago zeylanica L)别名为“白雪花”“三钱三”或“猛老虎”，白花丹有效成分为白花丹醌(plumbagin)。众多研究结果表明，白花丹醌具有抗炎、抗菌、抗氧化应激、抗肝纤维化、抗肿瘤等药理学作用[6-8]。然而，白花丹醌对肝纤维化的作用机制尚不清楚，需要进一步研究。本实验分离培养原代HSC，经TGF-β1诱导，观察白花丹醌对原代HSC的影响，检测其对ROS表达及TGF-β1/Smad信号的影响，探讨白花丹醌的潜在抗肝纤维化机制，为民族医药深入开发利用及其临床应用提供实验基础和理论依据。
1 材料 1.1 实验动物SD大鼠，体质量(140~180) g，购自广西医科大学实验中心，生产批号：SCXK-Gui-2014-0002。
1.2 药物与试剂白花丹醌(Sigma公司，批号：20071028)；0.25%胰酶(Gibco公司，批号：15050065)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：P0010)、磷酸酶抑制剂(批号：S1873)，均购自碧云天公司；兔多抗p-Smad2/3(CST公司，批号：8828)；兔单抗Smad2/3(Abcam公司，批号：Ab202445)；兔多抗Smad7(武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1399)；DCFH-DA(批号：S0033)、DAPI(批号：C1002)，均购自碧云天公司；Collagen Ⅲ抗体(三鹰公司，批号：22734-1-AP)；TGF-β1(Peprotech公司，货号：100-21)。
1.3 仪器IX51倒置显微镜(Olympus公司)；MULTISKAN MK3酶标仪(Thermo公司)；DYCZ-24DN垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；HI650离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；T8-1磁力搅拌器(江苏省金坛市中大仪器厂)。
2 方法 2.1 原代大鼠HSC的分离与培养大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5 000 U肝素钠抗凝；皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；以16号套管针作门静脉插管，37 ℃灌注D-Hanks液，10 mL·min-1至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；以0.1%链霉蛋白酶E 5 mL·min-1灌注3~4 min，0.03%Ⅱ型胶原酶5 mL·min-1灌注3~4 min；取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006%、DNA酶至终浓度为10 pug/mL。37 ℃、5% CO2孵箱内消化30 min；过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液; 4 ℃、800×g平抛离心30 min。吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次，加入无血清RPMI l640培养液，于37 ℃、5% CO2孵箱孵育15 min，吸取细胞悬液，在6孔板中以含20%胎牛血清的RPMI 1640培养。24 h后换液，此后每3 d换液1次[9]。
2.2 MTT法检测HSC增殖情况经过原代细胞的分离培养，用完全培养基调整细胞密度到3×104个接入96孔板，每孔100 μL细胞悬液，每组设3个复孔，分别加入白花丹醌(1、2、4、8、16 μmol·L-1)，同时设空白组。37 ℃培养24 h；接着每孔加入10 μL MTT，37 ℃培养4 h；吸出培养基，加入150 μL DMSO震荡10 min。酶标仪测定各孔吸光度值(OD568)，计算细胞活力抑制率。细胞活力抑制率/%=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。
2.3 荧光探针法测定细胞内ROS水平取对数生长期细胞，用完全培养基调整细胞密度到3×104个接种于96孔板，每组3个复孔，同时设空白对照组，每孔100 μL细胞悬液，同时设空白组，37 ℃培养过夜；按分组更换100 μL含白花丹醌(2、4、8 μmol·L-1完全培养基，37 ℃培养48 h；每孔更换终浓度为10 μmol·L-1 DCFH-DA的无血清DMEM培养基100 μL，37 ℃培养20 min；无血清培养基洗涤细胞3次；荧光酶标仪检测(激发光488 nm，发射光525 nm)。
2.4 Western blot检测Smad蛋白表达制备裂解液，低温提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各组蛋白浓度；将提取的蛋白上清与5×蛋白上样缓冲液放入沸水中，沸水浴10 min；制备5%浓缩胶和12%分离胶，上样后电泳分离，电转移120 min，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭PVDF膜，室温摇床封闭2 h，磷酸化蛋白用1%~3%的BSA封闭。一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5~6次，每次5 min。加入HRP标记二抗(1：50 000稀释)，37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜5~6次，每次5 min。将ECL工作液滴加于PVDF膜上，X线胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。
2.5 统计学分析使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，不同组之间通过单因素方差分析，然后两两对比分析。
3 结果 3.1 原代大鼠HSC形态变化倒置显微镜下观察大鼠HSC，在分离后d 1，HSC开始贴壁，细胞呈卵圆形状态，胞体变大、变平；细胞呈散在分布，可见单核或双核肝细胞；分离后d 3，细胞全部贴壁，胞质中脂滴减少、逐渐消失，HSC形态多样，部分细胞已出现多角伪足，呈星状；分离后d 5，HSC呈现不规则多角形，相邻HSC连接更加紧密，形成岛状或条索状；细胞呈对数生长期，细胞增殖速度增加，呈梭形；分离后d 8，细胞铺满培养板，细胞形态由梭形变为类纤维状(Fig 1)。
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| Fig 1 Morphological changes of primary rat HSC (×400) A:d 1; B:d 3; C:d 5; D:d 8. |
通过观察典型的HSC形态变化，分离的原代细胞活化后，经α-SMA免疫组织荧光鉴定，呈阳性表达，阳性率达91%, 获得了高纯度的大鼠原代HSC(Fig 2)。
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| Fig 2 Immunofluorescence identification of α-SMA (×200) A:α-SMA; B:DAPI; C:Merged |
MTT结果显示(Tab 1)，白花丹醌2~16 μmol·L-1对细胞活力的抑制率明显，且抑制率随浓度的增加而提高。为避免高浓度白花丹醌对细胞毒性的未知影响，后续实验选择白花丹醌2、4、8 μmol·L-1作为实验浓度。
| Group | Concentration /μmol·L-1 |
OD (24 h) |
Inhibitory rate/% |
| Control | - | 0.388±0.021 | - |
| Plumbagin | 1 | 0.381±0.021 | 2 |
| 2 | 0.329±0.016* | 15 | |
| 4 | 0.186±0.013** | 52 | |
| 8 | 0.129±0.009** | 67 | |
| 16 | 0.059±0.011** | 85 | |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs control | |||
如Fig 3所示，正常的HSC随着培养天数的增加，数量不断扩增，细胞形态由原来的星状结构变为肌纤维状。从细胞的形态来看，与空白组比较，TGF-β1组越来越多细胞更接近于肌纤维状；与TGF-β1组比较，NADPH氧化酶抑制剂DPI及白花丹醌各浓度组可以抑制HSC向肌纤维状变化，保持HSC的星状结构，使细胞更长时间处于静息状态。
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| Fig 3 Morphological observation of HSC (×200) A:Control; B:TGF-β1 (5 μg·L-1); C:DPI (10 μg·L-1); D:Plumbagin 2 μmol·L-1; E:Plumbagin 4 μmol·L-1; F:Plumbagin 8 μmol·L-1. |
荧光探针法检测结果显示(Fig 4)，与空白对照组相比，模型组HSC内绿色荧光明显增强，表明ROS水平明显升高。与模型组相比，给药组细胞内绿色荧光信号明显减弱，DPI组和白花丹醌各浓度组可不同程度下调ROS的水平，随着白花丹醌浓度的增加，HSC内荧光强度明显减弱，且绿色荧光的细胞数明显减少。另外，与模型组相比，DPI组和白花丹醌组ROS荧光密度值明显降低，与正常组比较，差异无显著性。
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| Fig 4 Effect of plumbagin on ROS production in HSC (×200) A:Control; B:TGF-β1; C:DPI; D:Plumbagin 2 μmol·L-1; E:Plumbagin 4 μmol·L-1; F:Plumbagin 8 μmol·L-1; G:ROS fluorescence density(x±s, n=6);1:Control; 2:TGF-β1;3:DPI; 4: Plumbagin 2 μmol·L-1; 5:Plumbagin 4 μmol·L-1; 6:Plumbagin 8 μmol·L-1. **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TGF-β1. |
如Fig 5所示，与对照组比较，TGF-β1刺激的HSC中α-SMA和collagen Ⅲ呈现阳性表达，表明细胞造模成功。随着白花丹醌浓度的增加，α-SMA和collagen Ⅲ表达逐渐下调，DPI组与白花丹醌处理组中α-SMA和collagen Ⅲ表达均降低。
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| Fig 5 Effect of plumbagin on α-SMA in HSC (×200) |
Fig 6的Western blot结果显示，与对照组比较，TGF-β1刺激组中p-Smad2/3、Smad2/3表达升高，而Smad7表达降低；与TGF-β1组比较，DPI组及白花丹醌各浓度处理组中p-Smad2/3的表达降低，抑制其活性，但总Smad2/3无明显变化；相反，DPI及白花丹醌各浓度处理组中，Smad7蛋白水平明显上升，差异有统计学意义。
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| Fig 6 6 Effect of plumbagin on protein expression of Smad in HSC detected by Western blot (x±s, n=6) 1:Control; 2:TGF-β1; 3:DPI; 4:Plumbagin 2 μmol·L-1; 5:Plumbagin 4 μmol·L-1; 6:Plumbagin 8 μmol·L-1. **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs TGF-β1. |
肝纤维化在多种慢性肝病的发展阶段常见，其特征在于肝脏内ECM的过度沉积导致[10]。现已证明，由NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)产生的ROS是细胞内信号转导的第二信使，介导了各种促肝纤维化因子的细胞内信号转导。研究表明，ROS可直接刺激HSC的增殖与活化，促进肝纤维化的发生[11]。本研究结果显示，HSC经过白花丹醌(2~16 μmol·L-1)处理后，对细胞活力的抑制率高于10%，对TGF-β1刺激的活化型HSC的生长具有明显的抑制作用。TGF-β1刺激的模型复制成功后，给予白花丹醌作用24 h后，HSC由肌纤维状变为星状结构，使细胞由活化状态转为静息状态，对细胞的增殖有抑制作用；荧光探针法检测结果显示，白花丹醌药物组可不同程度下调HSC中ROS水平，提示白花丹醌抑制HSC增殖和活化功能的机制之一可能与下调ROS等抗氧化功能有关。此外，α-SMA是HSC活化的标志之一，白花丹醌可降低HSC中α-SMA蛋白表达，从而使HSC更多的处于静息状态。
TGF-β超家族是一组多功能多肽，包括TGF-β1、骨形态发生蛋白、抑制素和激活素。与肝硬化密切相关的TGF-β由5个成员组成，TGF-β1~TGF-β5，其中只有TGF-β1与肝纤维化相关[12]。TGF-β1广泛存在于动物的正常组织和转化细胞中，骨组织和血小板中含量最丰富[13]。它可以抑制增殖，诱导细胞分化和免疫抑制，促进ECM合成，调节胶原蛋白的产生和组织修复。TGF-β1浓度在正常肝脏中较低，但在肝脏损伤发生时明显增加。当肝纤维化期间由各种致病因子诱导时，肝实质细胞、库普弗细胞、窦状内皮细胞、成纤维细胞、血小板和其他迁移性炎症细胞可释放大量TGF-β1。此外，活化的HSC最终成为TGF-β1产生的主要来源，形成正反馈回路[14]。本研究体外实验也证实，HSC可被TGF-β1激活，白花丹醌可抑制HSC中Smad信号通路的表达，从而抑制细胞活化，减缓肝纤维化进程。
TGF-β1/Smad信号通路由3部分组成：细胞外TGF-β1、膜结合TGF-β1受体和细胞内Smad蛋白。存在至少5种不同类型的TGF-β1受体，其中TβR-I和TβR-II是信号转导受体，其是信号转导所必需的。TβR是包含跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体，在没有配体的情况下，它们仍然是二聚体。一旦TGF-β1与其受体结合，即TβR-I和TβR-II激活，然后催化下游Smad分子上丝氨酸残基的磷酸化。最后，磷酸化的Smad进入细胞核，并调节与肝纤维化相关的靶基因的转录。Smad是I型受体中唯一已知的细胞内底物。Smad家族蛋白包括至少9种Smad蛋白，即Smad 1~9，其分为受体激活的Smad(R-Smad)，共同途径Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(I-Smad)。R-Smad蛋白，如Smad2和Smad3，主要可促进肝纤维化，而I-Smad如Smad7，可抑制或调节TGF-β信号转导，并抑制肝纤维化。由于TGF-β1/Smad信号转导途径在肝纤维化中的重要作用，阻断其信号转导是预防和治疗肝纤维化的潜在策略[15]。本研究发现，白花丹醌下调Smad2/3和p-Smad2/3的表达，并上调Smad7的表达，从而抑制TGF-β1/Smad信号通路。
总之，白花丹醌是从白花丹中提取的有效抗纤维化成分。白花丹醌可以调节ROS的表达；在TGF-β1/Smad信号转导途径中，白花丹醌也下调α-SMA、Smad2/3和p-Smad2/3的表达，上调Smad7的表达。提示白花丹醌可能通过降低ROS的产生，从而抑制HSC的活化。因此，白花丹醌是治疗肝纤维化的潜在药物。
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