2. 锦州医科大学附属第一医院外科重点实验室，辽宁 锦州 121000
2. Key Lab of Surgery, the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou, Liaoning 121000, China
舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是口腔癌中最常见的恶性肿瘤之一, 与其他口腔恶性肿瘤相比，其恶性程度高，生长快，浸润性强[1]。在过去的几十年中，尽管对TSCC的诊断和治疗取得了进展，但发病率和死亡率并没有降低。舌癌的主要治疗策略是彻底的外科手术和放化疗，由于其早期症状不明显，不易被发现，失去了最佳的手术治疗时期，而化疗药的毒副作用较大，因此，寻找毒副作用少且对舌癌有抑制作用的药物尤为重要。积雪草酸(asiatic acid，AA)属于五环三萜酸，结构见Fig 1, 主要来源于伞形科植物积雪草(Centella asiatica)，最早常用于促进伤口愈合。近年来，已发现AA具有许多生物活性，如抗炎护肤、保肝、降血糖、抗氧化、神经保护、心肌保护，引起了人们极大的研究兴趣[2-3]。近年来一些研究显示，AA也是促进肿瘤细胞凋亡且毒副作用小的天然产物。Wu等[4]在裸鼠成瘤模型上证实，AA可以抑制肺癌肿瘤的生长，而对正常细胞无明显影响。AA对舌癌TCA-8113细胞的抗肿瘤作用尚未有报道，因此，本研究观察了AA体外对舌癌TCA-8113细胞增殖、凋亡和细胞周期阻滞的影响，并探讨了其可能的作用机制。
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| Fig 1 Chemical structural of asiatic acid |
人舌癌TCA-8113细胞，由锦州医科大学附属第一医院外科重点实验室赠予。
1.1.2 药物与试剂AA(货号:464-92-6, 批号:JZ18030112)，购自南京景竹生物科技有限公司，纯度>98%，分子式C30H48O5，分子质量488.7，溶于DMSO，DMSO终浓度小于0.1%。MTT、Hoechst 33342、二甲基亚砜(DMSO)、结晶紫(北京Solarbio公司)；胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)；细胞凋亡试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)；细胞周期检测试剂盒(沈阳万类生物科技公司)；Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、β-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；ECL Plus试剂盒(美国Thermo公司)。
1.1.3 仪器CO2培养箱(Thermo Fisher Scientific公司)；倒置显微镜(日本Olympus)；倒置荧光显微镜(德国Leica)；流式细胞仪(美国BD Biosciences)；全自动酶标仪(美国Biotek)；MINIVE垂直蛋白电泳(美国Amersham Biosciences)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养舌癌TCA-8113细胞用含10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI 1640, 放在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2~3 d换1次液，细胞生长到皿底80%~90%时，进行传代培养或实验。
1.2.2 MTT检测TCA-8113细胞活力取对数生长期TCA-8113细胞，将每孔约8×103个细胞置于96孔板中至细胞贴壁，弃旧培养液，每孔加入含不同浓度AA(0、20、30、40、50 μmol·L-1)的100 μL培养基，每组设6个复孔，培养24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)继续培养4 h后，每孔加150 μL DMSO，酶标仪检测490 nm处的OD值。细胞活力/%=(OD给药组-OD空白组/OD对照组-OD空白组)×100%。
1.2.3 克隆形成实验检测TCA-8113细胞克隆形成取对数生长期细胞，铺6孔培养板，每孔细胞约1×103个，设置对照组、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)处理组，作用时间为1周，每2 d换液1次，药物浓度保持不变。然后用PBS轻轻漂洗2次；甲醇固定30 min，PBS轻轻漂洗3次；结晶紫染色25 min，PBS漂洗4~5次；晾干，相机拍照。
1.2.4 Hoechst 33342染色观察TCA-8113细胞凋亡形态取对数生长期的TCA-8113细胞，6孔板中每孔约铺1×104个细胞，培养至细胞长满孔底80%，设对照组、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)处理组，加入10 mg·L-1 Hoechst 33342染色液(1 000：1)，染色15 min后，PBS洗3次，用荧光显微镜(×200)观察细胞形态，并记录图像。
1.2.5 流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测TCA-8113细胞的凋亡率培养细胞至对数生长期，设空白对照组、AA(20、30、40、50 μmol·L-1)处理组，作用24 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，取约4×105~5×105个细胞，并在离心管中1 200 r·min-1离心5 min。用预冷PBS混匀，冲洗，取100 μL流式缓冲液重悬细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，避光4 ℃孵育15 min，再加400 μL的PBS，移入流式管中，通过流式细胞术检测细胞凋亡率。Q1区表示坏死细胞及机械损伤细胞，Q2表示晚期凋亡细胞，Q3表示活细胞，Q4表示早期凋亡细胞。
1.2.6 流式细胞术分析TCA-8113细胞周期收集用AA处理24 h的细胞及对照组细胞，根据细胞周期检测试剂盒的说明调整细胞密度，固定，添加RNaseA，并添加碘化丙啶染色溶液，转移到流式管中，上机分析细胞周期。
1.2.7 Western blot检测相关蛋白表达用AA(0、20、30、40、50 μmol·L-1)作用TCA-8113细胞24 h，细胞刮刀收集细胞，在冰盒上用细胞裂解液(裂解液：PMSF=100：1)将细胞裂解30 min，每8 min摇动1次，4 ℃、12 000 r·min-1离心25 min。BCA蛋白试剂盒测定蛋白质浓度，制样并在沸水中变性10 min。取蛋白样品，行SDS-PAGE电泳，电湿转至PVDF膜，用3% BSA封闭液封闭1.5 h后，加入一抗(1：1 000)4 ℃过夜，以TBST漂洗后，加入二抗(1：1 000)室温孵育1 h，用TBST冲洗3次，最后用ECL显色试剂盒显色。
1.3 统计学分析所有数据表示为x±s，两独立样本采用t检验，进行正态性检验和方差齐性检验的多组间比较用单因素方差分析，统计分析由SPSS 22.0软件完成。
2 结果 2.1 AA抑制TCA-8113细胞的增殖Fig 2的MTT结果显示，随着AA浓度的增加，人舌癌TCA-8113细胞的活力明显降低，其作用24 h的IC50值为42.13 μmol·L-1。
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| Fig 2 Effect of AA on viability of TCA-8113 cell (x±s, n=6) **P < 0.01 vs control |
如Fig 3所示，对照组细胞克隆形成能力为100%，随着AA浓度的增大，克隆形成能力明显降低(P＜0.01)。
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| Fig 3 Effect of AA on colony-formation ability of TCA-8113 cells (x±s, n=5) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
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| Fig 4 Effect of AA on nuclear morphology change of TCA-8113 cells (×200) |
Hoechst 33342染色时，在荧光显微镜下观察到正常细胞核显示出弱的蓝光，而凋亡细胞核显示出致密的亮蓝色荧光。如Fig 4所示，对照组TCA-8113细胞核呈微弱荧光，随着AA浓度的增大，细胞核的蓝色荧光致密且亮，与AA浓度呈正比。流式细胞仪结果如Fig 5所示，AA(20、30、40、50 μmol·L-1)逐渐诱导TCA-8113细胞的凋亡。
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| Fig 5 Effect of AA on apoptosis of TCA-8113 cells (x±s, n=5) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
流式分析细胞周期分布情况，检测细胞周期改变是否参与AA诱导TCA-8113细胞凋亡的过程。Fig 6、Tab 1结果显示，不同浓度AA作用24 h后，TCA-8113细胞在G2/M期明显停滞(P＜0.05)。
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| Fig 6 Cell cycle distribution of TCA-8113 cells after treatment with AA for 24 h (x±s, n=5) |
| AA/μmol·L-1 | Cell cycle/% | ||
| G0/G1 | S | G2/M | |
| 0 | 58.6±0.9 | 37.8±0.8 | 3.7±0.3 |
| 20 | 54.4±1.5* | 38.7±0.9 | 5.3±0.6* |
| 30 | 53.6±0.5* | 35.3±0.4 | 11.3±0.7* |
| 40 | 40.8±0.7* | 34.3±0.6 | 24.2±1.0* |
| *P＜0.05 vs control group | |||
如Fig 7所示，与对照组相比，AA组Bcl-2表达降低，而Bax、cleaved caspase-3蛋白水平均明显增加，具有一定程度的浓度依赖性(P＜0.01)。
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| Fig 7 Effect of AA on expression of Bax, Bcl-2 and cleaved caspase-3 in TCA-8113 cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
如Fig 8所示，AA呈浓度依赖性增加p53、p21蛋白的表达(P＜0.05)。
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| Fig 8 Effect of AA on expression of p53 and p21 in TCA-8113 cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
TSCC是全球口腔癌中发病率和死亡率的主要原因，全世界约50%的舌癌患者存在晚期疾病, 经手术完整切除后，癌症仍有复发和转移的可能性，严重影响了患者的生活质量。因此，如何抑制舌鳞癌的增殖、诱导其凋亡，是目前抗肿瘤治疗的热点问题。AA可抑制各种肿瘤细胞，如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和肺癌的增殖和分化。然而，特异性抗癌机制非常复杂，涉及线粒体凋亡和细胞周期分布。Aktarul等[5]研究表明，在大鼠结肠癌模型中，AA能抑制癌前病变、炎症、细胞增殖和诱导细胞凋亡，而对结肠黏膜细胞无毒性作用。Chen等[6]研究表明，AA能抗顺铂引起的急性肾损伤，对小鼠的正常细胞无影响。以上研究结果说明，AA有可能作为低毒高效的抗肿瘤药物应用。本研究利用不同浓度的AA处理人舌癌TCA-8113细胞，MTT结果显示，其IC50值为42.13 μmol·L-1，确定了后续实验所用AA浓度(20、30、40、50 μmol·L-1)，即达到了抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡的效果，又不会产生毒副作用。此外，AA处理的舌癌细胞的克隆生长被阻断，进一步证实了AA的抗肿瘤活性，但其作用机制不明。
Hoechst 33342染色是观察AA诱导细胞凋亡变化的最直观方法。随着AA浓度的增高，舌癌TCA-8113细胞体积大小不一，细胞核或细胞质呈致密浓染的颗粒状荧光，在凋亡细胞中，清楚地观察到具有高蓝色荧光强度的凋亡小体。通过流式细胞术检测AA作用于舌癌TCA-8113细胞后荧光强度，反映凋亡情况，实验结果显示，AA处理TCA-8113细胞24 h后，细胞凋亡率逐渐增加，最高可达79.42%。
细胞凋亡主要表现为核凝聚和碎裂，凋亡小体出现，未见质膜破裂。目前，已知肿瘤细胞凋亡通路有多种，主要依赖线粒体通路和凋亡受体通路两种方式。在细胞凋亡过程中，许多凋亡信号汇聚于线粒体，Bcl-2家族成员通过整合凋亡信号，使细胞色素C释放，协调caspase-3激活，从而使线粒体外膜的通透性增加[7]。p53蛋白分子作为转录因子，能够上调Bax的表达，从而对抗Bcl-2的抗凋亡作用[8]。Bcl-2族系的凋亡相关蛋白，如Bcl-2、Bax、Bcl-xl都锚定于线粒体膜中，它们能阻止或促进细胞色素C的释放，进而影响细胞的程序性死亡[9-10]。Bax表达增加能够促进细胞色素C释放到细胞质中，而Bcl-2抗凋亡蛋白能够保持线粒体完整性来阻止细胞色素C的释放。因此，Bcl-2蛋白表达降低有利于细胞色素C从线粒体中释放出来，有助于caspase-3激活，活化的caspase-3被认为是细胞凋亡的生物标记物[11]。本研究Western blot结果显示，AA抑制Bcl-2表达的同时，增加Bax的表达，导致caspase-3表达增加，且呈浓度依赖性。
细胞周期控制是一个高度调控的过程，涉及一系列复杂的信号，大多数癌细胞在G1检查点发生分裂，导致依赖G2检查点来调节细胞复制。正常细胞依靠G1检查点来保护自己免受DNA损伤。因此，影响G2/M细胞周期的药物对正常细胞的危害较小[12]。p53作为一种肿瘤抑制蛋白，通过诱导p21依赖性细胞周期阻滞或凋亡，来控制细胞对刺激因素应激的长期反应[13]。本实验通过流式细胞术分析舌癌TCA-8113细胞的细胞周期，不同浓度的AA作用TCA-8113细胞24 h后，细胞周期在G2/M期逐渐被阻断，且呈浓度依赖性。此外，我们检测了p53及p21的表达，发现在AA处理后p53和p21上调。这些数据表明，AA诱导的G2/M期阻滞与p53、p21上调有关。这与Hsu等[14]报道的AA可以诱导人乳腺癌细胞阻滞在S-G2/M期，以及Zhang等[15]发现在多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞中，AA处理也导致G2/M期阻滞相一致。
综上所述，本研究表明，AA抑制舌癌TCA-8113细胞的增殖作用主要通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞在G2/M期来完成。AA诱导TCA-8113细胞凋亡的机制可能与调控p53通路相关蛋白p53、p21、Bax及抑制Bcl-2有关。随后的实验将探索AA抑制细胞增殖和动物实验的更多分子机制。
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