2. 湖北科技学院 临床医学院,湖北 咸宁 437100
2. Hubei University of Science and Technology, Clinic Medical College, Xianning, Hubei 437100, China
近年来,由于人口的增长和老龄化,心脏疾病的发病率不断升高,防治心脏疾病已经成为国家社会共同面对的巨大问题。全球每年死于心脏疾病人数约350万人。心脏疾病是美国的十大死因之首[1]。心肌病是心脏疾病的一种,给社会和个人带来了极大的健康威胁和经济负担,因此,寻找防治心肌病治疗的靶点和途径刻不容缓。现发现很多因素参与心肌病发生、发展,目前认为RNA结合基序蛋白20(RNA-binding motif protein 20,RBM 20)与心肌病密切相连。本文主要围绕近年来RBM 20调控机制的研究进行综述。
1 RBM 20的结构与功能RBM 20由14个外显子组成,编码具有原型RNA识别基序1(RRM-1)的RNA结合基序蛋白20,在横纹肌尤其是心肌中高度表达[2]。RBM 20蛋白含有其他剪接因子常见的典型结构域,包括富含脯氨酸、谷氨酸的结构域,原型核糖核酸识别基序(prototypical ribonucleic acid recognition motif,RRM),富含精氨酸/丝氨酸的结构域(arginine/serine-rich domain,RS)和U1锌指结构域。其中,RRM和RS是两个高度保守的功能结构域,对于蛋白质的核保留是必需的[3]。日益认为RBM 20结构的变化与心脏疾病密切相关。RBM 20中鉴定出第1个突变涉及肌联蛋白(Titin)的选择性剪接。近几年,陆续发现多种基因突变,突变热点发生在RRM和RS结构域:V535I、R634Q、R634W、S635A、R636C、R636H、R636S、S637G、P638L,以及突变热点外的富含谷氨酸结构域:E913K以及位于外显子9的R716Q。RBM 20突变可能导致RBM 20蛋白错误折叠,并干扰其与目标RNA序列结合的能力,也可能干扰RBM 20的核定位[4-5]。
选择性剪接在心脏适应性反应中起主要作用,剪接因子序列的改变或突变导致的基因产物的错误剪接,是多种人类遗传疾病的根本原因。研究表明,RBM 20对RNA剪接体的形成和选择性剪接起调控作用。剪接体是在剪接过程中从转录前体信使RNA(RNA precursors,pre-mRNAs)中去除内含子的核糖核蛋白复合物。RBM 20直接调节心脏依赖的RNA加工转录因子,影响下游基因的表达模式,从而导致心脏疾病[6]。RNA测序表明,RBM 20选择性剪接与心肌病、离子稳态和肌节生物学密切相关的31个基因具有关联性。最近的一项研究表明,在大鼠心脏组织中,有18个基因直接与RBM 20结合,并受RBM 20选择性剪接,在这些基因中,RBM 20对Titin、钙/钙调蛋白调节激酶Ⅱδ(Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱδ,CaMKⅡδ)、钙离子通道基因CACNA1C、横纹肌LIM域结合蛋白3(LIM-domain-binding protein 3,LDB 3)、阿诺碱受体2(ryanodine receptor 2,RyR 2)进行保守的差异剪接[7]。RBM 20的选择性剪接功能与心肌病的发生、发展密切相关。
2 RBM 20与心肌病扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一种以左心室扩大和收缩功能降低为特征的常见病症,具有高渗透性、侵袭性,不可避免地导致心力衰竭。2009年,人们首次发现,家族性DCM患者的RBM 20 RS结构域发生突变,因为RBM 20在心肌中高度表达,并且编码调控前信使RNA的剪接体,因此认为其与人类心肌病密切相关[8]。现已发现,RBM 20是DCM中突变频率最高的基因之一,RBM 20突变会导致DCM、进行性心力衰竭和猝死,在高达3%的特发性DCM患者、5%的确诊或疑似家族性病例和超过13%的有心源性猝死病史的患者中,都发现了RBM 20突变。随后的研究发现,RBM 20基因敲除的大鼠和具有RBM 20突变的人都患有心肌纤维化、心律失常和猝死,这说明RBM 20参与DCM的发生过程。动物实验表明,RBM 20敲除会导致DCM。基因敲除大鼠生理表现为最大心输出量降低,骨骼肌功能下降,左心室电镜观察到肌原纤维排列异常,脂褐素沉积[9]。此外,细胞水平上也验证了RBM 20的功能。在RBM 20敲除的小鼠的心肌细胞中,RBM 20突变会导致Titin向更有弹性的亚型转变,RBM 20缺陷导致肌节组织紊乱和肌浆网中离子转运受损,最终导致DCM。多能干细胞中的RBM 20突变或RBM 20敲除重现了DCM患者的分子缺陷,与健康组相比,RBM 20突变多能干细胞组表现出α-辅肌动蛋白的异常分布、钙处理紊乱以及N2B亚型的表达水平降低[10-11]。
心肌病的终末阶段会发生心力衰竭,射血分数保留型心衰(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)是一种以心室充盈功能受损为特征的复杂临床综合征,左心室僵硬度增加是HFpEF的重要特征。左心室僵硬程度由细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和心肌细胞调节,而Titin调控ECM和心肌细胞的被动刚度。实验表明,通过调节RBM 20表达水平来调节Titin剪接,有利于心脏在心衰时保持射血分数。在Titin N2B亚型敲除小鼠中,RBM 20活性降低了50%,维持了心脏充盈舒张,改善了心脏萎缩,一定程度上恢复了与脂肪酸代谢以及横纹肌发育相关的基因表达[12]。在RBM 20等位基因RRM敲除的小鼠模型心脏中,顺应性的Titin亚型大量表达,于3周时达到最大表达量,舒张功能改善,最终导致左室顺应性增加,改善了左心室僵硬程度[13]。
3 RBM 20作用的调控机制 3.1 RBM 20与Titin肌节是横纹肌肌原纤维中最小的收缩单元,Titin是肌节中的第3类丰富蛋白,决定了横纹肌的结构和弹性,与人类心脏病密切相关。Titin可在横纹肌中产生数百万种亚型,心脏Titin主要产生两种主要亚型:短而僵硬的N2B亚型,以及更长、更有弹性的N2BA亚型[14]。根据发育阶段和物种的不同,这两种亚型之间的转换提供可变的被动刚度,以满足生理需求。心肌被动刚度的增加,可以防止舒张期间压力增加而导致的心室过度充盈。研究发现,Titin亚型的转变与心肌顺应性的变化、心脏疾病的发生密切相关。在一些心脏疾病中,Titin亚型比值发生变化。在健康人的左心室中,N2BA与N2B亚型的表达比约为30 :70,在收缩性心力衰竭的心脏中发现N2BA与N2B的比例增加,而舒张性心力衰竭N2BA与N2B比例下降。在RBM 20缺失的大小鼠模型中,N2BA/N2B发生变化,并且开始转换以更大分子质量的N2BA-G亚型存在,这说明RBM 20抑制Titin选择性剪接[6]。
RBM 20通过调控Titin pre-mRNA的剪接,抑制Titin的表达。RBM 20与Titin pre-mRNA中含有UCUU的RNA元件结合,并抑制结合区域中内含子的去除,除RNA元件的剩余pre-mRNA将被剪接并保留在细胞核中,等待进一步处理[7]。在人和大鼠中,Titin的错误剪接广泛存在,RBM 20缺乏时Titin表达增多。
RBM 20介导的Titin剪接是剂量依赖性的。在野生型大鼠心肌中,主要表达较小的N2B亚型; 在RBM 20敲除杂合大鼠中,高表达中等大小的N2BA; 在RBM 20敲除纯合大鼠中,表达大亚型N2BA-G。此外,研究表明,胰岛素和甲状腺激素可以通过激活磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of repamycin,PI3K/Akt/mTOR)信号通路,增加RBM 20表达,进而Titin亚型发生改变,降低了N2BA/N2B的比值; 相反,抑制PI3K或mTOR激酶,可明显降低剪接因子RBM 20的蛋白表达[15-16]。
有趣的是,RBM 20在由Titin基因形成的环状RNA(Circular RNA,CircRNA)的过程中起着重要作用。CircRNA是一种非编码RNA分子,心脏中约26%与外显子跳跃有关的CircRNA来源于Titin,Titin通过选择性剪接产生CircRNA。研究表明,在RBM 20敲除心脏中,有38个差异表达的CircRNA,其中12个来自Titin基因。这说明RBM 20参与Titin基因形成的CircRNA,但是现有实验表明,RBM 20并不是心脏CircRNA形成的整体调节因子。目前关于CircRNA的研究尚少,还需进一步探索[17]。
3.2 RBM 20与RyR 2阿诺碱受体参与心脏兴奋-收缩偶联的过程,是重要的Ca2+释放通道,发挥维持细胞的兴奋性的重要作用。RyR 2亚型主要在心肌和平滑肌细胞中表达。RyR 2由4个单体组成,每个单体结合1个调节蛋白FK 506结合蛋白12.6 (FK 506 binding protein 12.6,FKBP 12.6),FKBP 12.6和RyR 2结合,调节Ca2+释放通道的开放[18]。
心肌RyR 2的激活和失活受钙调素(calmodulin,CAM)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、CAMKII调节,同时FKBP 12、FKBP 12.6等也参与RyR2的调控。在CAM存在下,Ca2+激活PKA后,PKA磷酸化RyR 2,磷酸化的RyR 2与调节蛋白FKBP 12.6解离,钙离子通道开放; RyR 2的磷酸被磷酸酶水解下来,使RyR 2重新与FKBP 12.6结合,此时通道关闭。RyR 2的磷酸化程度决定RyR 2的功能状态,RyR 2的活性调节需要适当的磷酸化,但是过度的磷酸化会影响通道的正常功能。在心力衰竭的过程中,RyR 2的结构和功能发生了改变,影响了心脏的舒缩功能[7, 19]。有研究结果表明,在RBM 20敲除大鼠和RBM 20突变人中,RyR 2中1个24 bp外显子表达升高,这说明RyR 2的24 bp外显子受RBM 20表达量高低的调节。也有初步研究表明,RBM 20突变的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞中,RyR 2表达升高[6]。RyR 2的突变与心律失常性右室心动过速和猝死有关,心律失常和猝死都是RBM 20相关DCM的表征。最近的研究表明,RyR 2功能缺陷不仅与心律失常有关,还与心肌病有关。但是RBM 20调节RyR 2的机制尚未明确,仍需进一步研究。
3.3 RBM 20与PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K/Akt/mTOR信号通路参与细胞的生长、增殖、分化等多种活动。生长因子激活PI3K,然后质膜上产生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3, 4, 5-trisphosphate,PIP3),PIP3促使Akt活化。活化的Akt磷酸化激活下游靶蛋白mTOR,进而诱导细胞的生命活动[20]。PI3K/Akt/mTOR信号通路参与心肌病。PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活,可以减少心肌细胞凋亡程度,对缺血/再灌注损伤大鼠心肌具有保护作用; PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活调节下游靶的表达,减少急性心肌梗死的损伤; 在心肌肥大动物模型中,PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活; PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活参与心肌细胞过氧化损伤过程。
外部刺激导致的错误剪接可能改变N2B和N2BA的比值,从而损害心脏收缩功能。实验表明,RBM 20是胰岛素激活的PI3K/Akt信号通路的下游底物,RBM 20是该通路下游连接胰岛素与Titin剪接的重要蛋白。细胞水平上,胰岛素或甲状腺激素通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,增加RBM 20表达,进而增加N2B亚型的表达,而RBM 20敲除后,外部刺激不会改变N2B的表达; 在细胞和糖尿病动物水平上,PI3K或mTOR激酶的抑制明显降低了剪接因子RBM 20的蛋白质水平[15],观察到N2B亚型表达减少,而RBM20敲除后,未观察到N2B亚型表达的变化。RBM20与PI3K/Akt/mTOR信号通路的研究较少,仍需进一步探索。
3.4 RBM 20与LDB 3/CaMKIIδ/CACNA1CLDB 3又称Cypher基因,其编码蛋白Cypher主要在横纹肌中表达,位于肌小节的Z线上。LDB 3在收缩的机械应力下,保持着Z线的结构完整性,在肌细胞的结构和功能上起着重要作用[21]。对于LDB 3,外显子4与外显子5、6互相排斥,RBM 20通过使外显子4、5、6同时表达,而调控LDB 3的组织特异性剪接。缺乏RBM 20时,外显子4不表达,而外显子5和6表达。在RBM 20敲除大鼠和RBM 20突变的个体的左心室组织中,外显子4的表达下调[22]。
CaMKⅡδ是参与心脏中钙处理、基因转录和信号转导过程的关键酶,是通过对其底物受磷蛋白(phospholamban,PLB)、RyR和L型Ca2+通道(L-type Ca2+ channels,LTCC)的磷酸化,进行兴奋-收缩偶联的调节剂。大多表现为4种亚型:δ-A、δ-B、δ-C、δ-9。健康成人心脏中,表达最多的亚型是δ-B和δ-C,但是RBM 20的缺失,诱导向更大的δ-A和δ-9亚型转变。研究表明,RBM 20突变导致的CaMKⅡδ剪接受损是引起心肌病的重要原因之一。在体外,心脏发育期间敲除RBM 20,可检测到RBM 20缺乏的心肌细胞在分化后表现出病理性CaMKⅡδ[23]。CaMKIIδ的异常剪接可以影响钙稳态,并增加RBM 20突变个体猝死的风险。实验证明,在RBM 20敲除小鼠心肌细胞中,CaMKIIδ剪接异常,Ca2+处理受到严重扰乱,LTCC活性明显升高,导致L型Ca2+电流增加,收缩期Ca2+增加,肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)Ca2+增加。LTCC是RBM 20敲除心肌细胞中Ca2+超载的潜在原因[24],用LTCC拮抗剂维拉帕米阻断L型Ca2+电流可完全抑制SR自发性Ca2+释放,表明L型Ca2+电流密度升高可增加Ca2+内流,进而导致RBM 20敲除细胞内的SR Ca2+超载。
CACNA1C不同亚型的表达与心律失常有关。RBM 20突变引起CACNA1C改变,进而影响钙离子稳态,增高RBM 20突变体猝死的风险[25]。
4 结语随着基因测序技术的发展,人们发现剪接因子调控基因的表达。RBM 20参与心脏关键基因的剪接,与心肌病密切相关,RBM 20调控Titin亚型转换,被认为是导致心肌病的重要原因。但是由于RBM 20如何调节Titin剪接的机制尚不清楚,所以针对RBM 20治疗心肌病的研究还处于理论阶段。探寻是否有其他调节因子参与RBM 20调控Titin剪接过程,RBM 20与Titin pre-mRNA的结合位点,以及是否可以通过抑制RBM 20调节Titin亚型改善心肌损伤,都将成为治疗心肌病的新靶点和新手段。RBM 20调控多种与心脏疾病密切相关的基因,但其机制未明,仍需进一步探索。
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