2. 河南大学淮河临床学院，河南 开封 475004;
3. 河南大学药学院，河南 开封 475004
2. Huaihe Clinical College, Henan University, Kaifeng Henan 475004, China;
3. College of Pharmacy, Henan University, Kaifeng Henan 475004, China
氟喹诺酮类药物是广泛使用的临床一线抗感染药物，经过结构修饰有可能将此类药物改造成为抗肿瘤药物[1-2]。本研究用酰胺基作为氟喹诺酮C-3羧基的电子等排体，绕丹宁环为其修饰基，对氟苄叉基为修饰基的功能修饰侧链构建绕丹宁不饱和酮骨架，运用药效团拼合药物设计原理，设计合成了一系列N-(5-芳苄叉基绕丹宁)氟喹诺酮类衍生物，并进行了抗肿瘤活性筛选。结果显示，该类衍生物均具有较好的抗肿瘤活性，其中1-环丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-N-(5-对氟苄叉基-绕丹宁-3-基)-喹啉-4-(1H)-酮-3-甲酰胺(HGQ-15)活性最强，IC50值达3.89~4.53 μmol·L-1，具有进一步研究和开发的价值。在对新合成化合物的研究过程中，发现抗肿瘤药能够诱导肿瘤细胞自噬，并对肿瘤细胞的增殖和凋亡产生影响[3]。自噬现象可能是影响药物疗效和产生耐药机制的重要因素，是药物研究开发中需要重视的问题[4]。本文通过检测HGQ-15对人肝癌SMMC-7721细胞株的作用，初步研究了HGQ-15抑制细胞增殖，促进细胞凋亡以及与自噬作用的关系，为该类化合物抗癌作用的应用和开发提供一定的体外实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料人肝癌细胞系SMMC-7721，购自中国医学科学院基础医学研究所。N-(5-芳苄叉基绕丹宁)环丙沙星酰胺衍生物，由河南大学化学生物学研究所设计合成，HPLC法测定纯度＞99%。四甲基偶氮唑盐(MTT)(Solarbio公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(七海复泰公司)；Trigol总RNA提取试剂、鼠抗人β-actin单克隆抗体(鼎国昌盛公司)；兔抗LC3B多克隆抗体(Sigma)；氯喹(chloroquine，CQ)(Santa Cruz公司)。凝胶成像系统(UVP公司)；流式细胞仪(艾森公司)。
1.2 MTT法测定细胞存活率SMMC-7721细胞以1.5×107·L-1浓度接种于含HGQ-15的培养液培养，加入5 g·L-1 MTT 20 μL培养4 h，加入DMSO 150 μL振荡溶解, 测定570 nm处的吸光度(A)值并计算存活率。
1.3 AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡400 μL 1×Binding buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，避光孵育15 min。加入10 μL PI染色液，冰浴5 min，流式细胞仪检测，激发光波长为488 nm。
1.4 Western blot法检测细胞LC3表达低温提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE分离样品，转膜，封闭。一抗(1 :500)4 ℃震荡孵育过夜，二抗(1 :5 000)室温震荡孵育2 h，ECL显影。
1.5 Beclin-1基因沉默实验Beclin-1 siRNA的干扰正义序列：5′-UGAAUGAGGAUGACAGUGATT-3′，反义序列：5′-UCACUGUCAUCCUCAUUCATT-3′；正义序列：5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′，反义序列：5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′。转染使用siRNA-Mate转染试剂，按试剂盒说明操作。
1.6 统计学分析资料采用Excel和SPSS 17.0软件处理数据。计量资料用x ± s表示，组间比较采用F检验分析。
2 结果 2.1 HGQ-15抑制SMMC-7721细胞增殖HGQ-15(0.625~10.0 μmol·L-1)处理SMMC-7721细胞24、48、72 h，对细胞增殖有明显抑制作用(P < 0.05)，不同浓度HGQ-15对SMMC-7721细胞增殖抑制率数据见Tab 1。24、48、72 h的IC50分别为4.531 μmol·L-1(r2=0.874 2)、4.063 μmol·L-1(r2=0.857 3)和3.894 μmol·L-1(r2=0.959 0)。
| HGQ-15 /μmol·L-1 | 24 h | 48 h | 72 h |
| Control | - | - | - |
| 0.625 | 5.48±3.11* | 6.76±2.44* | 8.77±3.56* |
| 1.25 | 7.76±3.23* | 12.62±2.10* | 18.46±3.14* |
| 2.50 | 25.09±6.86* | 56.52±5.84** | 70.09±5.70** |
| 5.00 | 75.84±3.42** | 76.19±4.15** | 85.83±3.68** |
| 10.00 | 82.76±4.81** | 80.02±6.23** | 90.18±4.57** |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control | |||
随着HGQ-15浓度增加，凋亡细胞明显增多，细胞凋亡率见Tab 2。与对照组相比，差异有统计学意义(P < 0.01)。
| Group | Concentration/μmol·L-1 | Total cell | Apoptotic cell | Apoptotic ratio/% |
| Control | - | 135.69±15.21 | 4.08±2.75 | 3.01±1.42 |
| HGQ-15 | 1.25 | 148.92±12.45 | 30.79±7.54 | 20.68±2.97** |
| 2.50 | 142.27±11.43 | 44.49±6.23 | 31.27±3.51** | |
| **P < 0.01 vs control | ||||
不同浓度HGQ-15处理24 h后，SMMC-7721细胞LC3-Ⅱ的表达量增加，表明HGQ-15诱导SMMC-7721细胞发生自噬。
2.4 Beclin-1 siRNA和氯喹对HGQ-15抑制细胞增殖作用的影响Beclin-1 siRNA对SMMC-7721细胞增殖率的影响不明显，但Beclin-1 siRNA与HGQ-15(2.5 μmol·L-1)共同处理组细胞增殖率明显低于HGQ-15(2.5 μmol·L-1)单独处理组(P＜0.05)；单独使用6.25 μmol·L-1氯喹时，对SMMC-7721细胞增殖率影响较小，但氯喹与HGQ-15共同处理后，明显增加HGQ-15对细胞增殖的抑制效果(P＜0.05)。
2.5 Beclin-1 siRNA和氯喹对HGQ-15诱导细胞凋亡的影响与HGQ-15(2.5 μmol·L-1)单独处理组相比，HGQ-15(2.5 μmol·L-1)联合Beclin-1 siRNA组细胞凋亡率明显增高；HGQ-15(2.5 μmol·L-1)联合氯喹(6.25 μmol·L-1)组的细胞凋亡率也高于HGQ-15(2.5 μmol·L-1)单独处理组，差异有统计学意义(P < 0.05)。
3 讨论已有研究证明，通过改造碳-3羧基的氟喹诺酮衍生物显示出类似DNA拓扑异构酶Ⅱ毒剂的作用，能导致DNA损伤，诱导细胞凋亡[5]。本研究应用MTT法检测HGQ-15对SMMC-7721细胞增殖的影响，IC50值达到4.531 μmol·L-1。AnnexinⅤ-FITC/PI双染法观察HGQ-15对SMMC-7721细胞凋亡的影响，观察到随着HGQ-15浓度升高，凋亡细胞的比率明显。说明HGQ-15对SMMC-7721细胞的抑制作用与诱导凋亡作用有关。
本实验用Western blot方法检测自噬标志物LC3的表达，显示HGQ-15处理组表达量明显高于对照组，说明HGQ-15能够诱导细胞发生自噬。为探究HGQ-15诱导自噬与凋亡的关系，本研究应用RNA干扰技术下调自噬通路中关键蛋白Beclin1[6]和自噬抑制剂氯喹，阻断自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体的过程[7]，特异性抑制细胞自噬活动，观察自噬对细胞增殖和凋亡的影响。结果显示，Beclin-1基因沉默和氯喹(6.25 μmol·L-1)本身对细胞增殖影响甚微，但与HGQ-15联用后，可明显增加HGQ-15对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用(P < 0.05)。与此相一致的是，Beclin-1基因沉默和氯喹(6.25 μmol·L-1)与HGQ-15联合处理SMMC-7721细胞时，细胞的凋亡率明显高于HGQ-15单独处理组(P < 0.05)。提示在HGQ-15导致SMMC-7721细胞凋亡过程中所诱导的细胞自噬，对细胞具有保护作用，通过自噬作用减少HGQ-15对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用，并降低细胞的凋亡率。
| [1] |
Fedorowicz J, Saczewski J. Modifications of quinolones and fluoroquinolones:hybrid compounds and dual-action molecules[J]. Monatsh Chem, 2018, 149(7): 1199-245. doi:10.1007/s00706-018-2215-x |
| [2] |
Bisacchi G S, Hale M R. A "double-edged" scaffold:antitumor power within the antibacterial quinolone[J]. Curr Med Chem, 2016, 23(6): 520-77. doi:10.2174/0929867323666151223095839 |
| [3] |
梁红霞, 余艺华, 王萌, 等. N甲基环丙沙星氟喹诺酮查尔酮类衍生物对人胰腺癌BxPC-3细胞凋亡和自噬的影响[J]. 中国药理学通报, 2018, 34(8): 1013-8. Liang H X, Yu Y H, Wang M, et al. Effect of N-methylciprofloxacin-based fluoroquinolone-chalcone derivative on the apoptosis and autophagy of human pancreatic carcinoma BxPC-3 cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2018, 34(8): 1013-8. |
| [4] |
Gewirtz D A. The four faces of autophagy:implications for cancer therapy[J]. Cancer Res, 2014, 74(3): 647-51. doi:10.1158/0008-5472.CAN-13-2966 |
| [5] |
Sun J P, Shi Z Y, Liu S M, et al. Trimethoxy-benzaldehyde levofloxacin hydrazone inducing the growth arrest and apoptosis of human hepatocarcinoma cells[J]. Cancer Cell Int, 2013, 13(1): 67. doi:10.1186/1475-2867-13-67 |
| [6] |
Liu L, Zhao W M, Yang X H, et al. Effect of inhibiting Beclin-1 expression on autophagy, proliferation and apoptosis in colorectal cancer[J]. Oncol Lett, 2017, 14(4): 4319-24. doi:10.3892/ol.2017.6687 |
| [7] |
Pasquier B. Autophagy inhibitors[J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(5): 985-1001. doi:10.1007/s00018-015-2104-y |