2. 湖南中医药大学预防医学教研室，湖南长沙 410208;
3. 湖南中医药大学生理学教研室，湖南长沙 410208;
4. 湖南中医药大学病原生物学教研室，湖南长沙 410208
2. Dept of Preventive Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;
3. Dept of Physiology, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;
4. Dept of Microbiology, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
研究表明，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)占终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的30%~47%，是糖尿病患者死亡的主要原因[1]。足细胞(podocyte)损伤是导致蛋白尿持续发生和DN进展的重要原因。足细胞损伤与凋亡增加密切相关，高糖状态下，足细胞内活性氧(reactive oxygen specie，ROS)的生成增多[2]，可能通过JNK1信号通路，导致Bcl-2磷酸化，从而促进足细胞凋亡，裂孔隔膜蛋白Podocin丢失，导致蛋白尿的产生[3-4]。
金匮肾气汤是温补肾阳、化气行水的代表方。研究发现，金匮肾气汤能通过调节Bcl-2/Fas基因表达，从而抑制肾小球细胞凋亡[5]。本研究旨在通过db/db糖尿病小鼠模型，观察金匮肾气汤对足细胞凋亡和JNK1/Bcl-2信号通路的影响，探讨金匮肾气汤改善DN进展的分子机制，为临床防治DN提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 动物模型的建立4周龄♂SPF级C57BL/KsJ-db/db小鼠15只，作为Ⅱ型糖尿病动物模型；4周龄♂C57BL/KsJ-db/m小鼠5只，作为对照组(control)。小鼠购自上海市斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002，实验单位使用许可证号：SYXK(湘)2014-0012。6周龄时，将15只db/db小鼠随机分为3组，并灌胃，分别为：生理盐水组(db/db, n=5)，金匮肾气汤组(db/db+JG，n=5)，二甲双胍阳性对照组(db/db+MF, n=5)。于18周龄时处死小鼠。
1.2 药物制备金匮肾气汤各配方颗粒购自江阴天江药业有限公司，成人每日量10 g，包括熟地黄4 g(相当于饮片量为10 g，下括号内数值同)，茯苓颗粒1 g(10 g)，牡丹皮颗粒1 g(6 g)，泽泻1 g(10 g)，山药0.5 g(10 g)，酒萸肉1.5 g(6 g)，桂枝0.5 g(6 g)，附片0.5 g(3 g)。将每10 g颗粒充分溶解于加热后的蒸馏水中。药物根据动物/人体表面积法折算，结合前期实验结果，金匮肾气汤组为2.6 g·kg-1。盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司)，溶解于蒸馏水中，剂量为0.2 g·kg-1。
1.3 血糖、尿白蛋白检测小鼠18周龄时，留24 h尿液，用白蛋白测定试剂盒(宁波医杰生物科技有限公司)测定24 h尿白蛋白排泄量；尾静脉取血，用血糖仪(三诺GA-3血糖试条，三诺生物传感股份有限公司)检测随机血糖。
1.4 肾组织病理学检查处死小鼠后，留取双侧肾组织，一部分肾组织用4%多聚甲醛固定后，制备厚3 μm石蜡切片，进行过碘酸希夫反应(PAS)染色，用奥林巴斯BX-50显微镜观察肾小球内系膜区细胞外基质增生情况。另一部分肾组织用2.5%戊二醛固定后，制作成50~100 nm切片，用3%醋酸铀以及硝酸铅双染色，透射电子显微镜(日立H7700)观察肾小球足细胞超微结构。
1.5 免疫荧光采用间接免疫荧光染色法，按照试剂盒的操作步骤，检测足细胞标志蛋白Podocin(抗体购自Abcam公司，货号：ab50339)在肾小球内的表达。在共聚焦荧光显微镜(日本奥林巴斯)下对组织进行检测，肾小球内亮绿色为阳性结果。
1.6 Western blot检测一部分肾皮质(沿纵切面剖开肾脏后，沿皮髓分界线去除髓质)采用2×SDS裂解液提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转PVDF膜。脱脂奶粉室温封闭1 h后，分别加入p-Bcl-2(美国Santa Cruz公司)、JNK1(美国CST公司)、p-JNK1(美国CST公司)、caspase-3(美国CST公司)的一抗(1 :500或1 :1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加入二抗(1 :5 000)，室温孵育1 h，TBST洗3次，用ECL(美国ThermoFisher公司)显色并曝光，采用ImageJ软件进行条带灰度扫描。
1.7 统计学分析实验数据以x ± s表示，运用SPSS19.0统计软件进行分析。若数据符合正态分布及方差齐性，采用多组间单因素方差分析方法(LSD)；若数据方差不齐或不符合正态分布，进行秩转换后采用Kruskal-Wallis检验。
2 结果 2.1 金匮肾气汤对血糖和尿蛋白的影响为探讨金匮肾气汤对db/db小鼠的肾保护作用，本实验测定了血糖和尿白蛋白水平。Tab 1结果显示，db/db小鼠血糖和24 h尿白蛋白水平明显高于正常大鼠(P < 0.01)，提示db/db糖尿病小鼠肾功能受损。治疗后，二甲双胍可使db/db小鼠血糖和24 h尿白蛋白水平明显降低(P < 0.05)；金匮肾气汤组可明显降低db/db小鼠24 h尿白蛋白(P < 0.05)，但对血糖影响不明显，提示金匮肾气汤可减轻db/db小鼠肾脏损伤。
| Group | Blood glucose/mmol·L-1 | Urinary albumin/creatinine/mg·g-1 |
| Control | 8.5±1.8 | 1.7±0.2 |
| db/db | 24.2±2.1** | 12.3±2.8** |
| db/db+JG | 19.4±3.7 | 9.4±1.3# |
| db/db+MF | 17.7±4.7# | 9.7±1.3# |
| **P＜0.01 vs control; #P＜0.05 vs db/db | ||
采用PAS染色观察db/db小鼠肾小球的病理变化。根据2017年肾活检病理诊断报告模式专家共识[6]，肾小球系膜区增宽程度分为轻度(系膜区宽度 < 毛细血管襻直径)、中度(系膜区宽度>毛细血管襻直径)及重度(系膜基质挤压襻呈结节、团块或分叶状)。如Fig 1所示，与对照组相比，db/db小鼠生理盐水组肾小球系膜区明显增宽，呈中度增生；金匮肾气汤组及二甲双胍组小鼠肾小球内系膜区增宽程度较生理盐水组明显减轻，呈轻度增生。表明金匮肾气汤缓解了db/db小鼠肾小球系膜病变。
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| Fig 1 Pathological changes of kidneyin each group of mice(PAS, ×400) A: Control; B: db/db; C: db/db+JG; D: db/db+MF. Red arrow shows mesangial region in glomerulus. |
为了观察金匮肾气汤对足细胞损伤的保护作用，采用透射电子显微镜观察足细胞超微结构。如Fig 2所示，正常对照组小鼠肾小球足细胞足突清晰、呈指状覆盖在肾小球基底膜外；db/db糖尿病小鼠肾小球内足细胞足突倒伏、足突相互融合、部分足突消失；金匮肾气汤和二甲双胍治疗后，足突倒伏、足突融合情况明显好转，大部分足突呈指状覆盖在肾小球基底膜外。此外，我们采用免疫荧光标记肾小球内足细胞标志蛋白Podocin的表达。如Fig 3所示，Podocin在正常对照组小鼠肾小球内沿毛细血管襻呈均匀连续的线样分布；db/db糖尿病小鼠生理盐水组肾小球内线样分布的Podocin免疫荧光消失、呈微弱颗粒状荧光；金匮肾气汤和二甲双胍治疗后，肾小球内出现线样分布的Podocin免疫荧光。以上结果提示，金匮肾气汤可减轻db/db小鼠肾脏足细胞损伤。
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| Fig 2 Transmission electron microscopyof kidneys in different groups(×2 000) A: Control; B: db/db; C: db/db+JG; D: db/db+MF. Red arrow shows foot processes in podocyte. |
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| Fig 3 Immunofluorescence of podocinin kidneys of each group(×400) A: Control; B: db/db; C: db/db+JG; D: db/db+MF. Red arrow shows fluorescence(green) in glomerulus. |
Western blot检测肾组织中活化的caspase-3蛋白表达，如Fig 4所示，生理盐水组db/db小鼠肾皮质中活化的caspase-3表达比对照组明显升高(P < 0.01)；金匮肾气汤组和二甲双胍组小鼠肾皮质中caspase-3表达明显降低(P < 0.05)。提示金匮肾气汤的肾脏保护作用可能与改善糖尿病小鼠肾脏足细胞凋亡有关。
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| Fig 4 Expression of caspase-3 proteinin kidney cortex of each group(x ± s, n=5) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs db/db |
JNK1磷酸化后可使抗凋亡蛋白Bcl-2磷酸化，从而促进细胞凋亡。如Fig 5所示，生理盐水组小鼠肾皮质中p-JNK1/JNK1表达比对照组明显升高，p-Bcl-2蛋白表达明显增加(P < 0.01)；金匮肾气汤干预后，p-JNK1/JNK1表达下调，p-Bcl-2蛋白表达也明显下调(P < 0.05)。提示金匮肾气汤改善糖尿病小鼠肾脏足细胞凋亡的作用可能与调节JNK1/Bcl-2通路有关。
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| Fig 5 Expression of p-JNK1/JNK1 and p-Bcl-2protein in kidney cortex of each group(x ± s, n=5) **P < 0.01 vs control; #P < 0.05 vs db/db |
DN进展到肾功能衰竭的过程属阳气衰败、水湿瘀浊内聚，因此，当以温补肾阳、化气行水大法。金匮肾气汤是温补肾阳、化气行水的代表方。方中重用地黄滋补肾阴，臣以山药、山茱萸补肝脾，加肉桂、附子温阳化气，佐以泽泻、茯苓、丹皮利水渗湿泄肝火，广泛应用于泌尿生殖系统等疾病的治疗。
足细胞又称为肾小囊脏层上皮细胞，附着于肾小球基底膜外侧，与内皮细胞、肾小球基底膜共同构成肾小球滤过屏障，其中，足细胞间的裂孔隔膜是阻止大分子物质通过的分子屏障。Wang等[7]研究发现，DN的足细胞损伤主要是由于高糖抑制足细胞自噬水平，促进细胞凋亡，表现为标志蛋白Podocin、Nephrin表达明显降低，最终导致蛋白尿的产生。此外，有研究表明，高糖也可诱导肾小球系膜细胞凋亡，caspase-3表达增加、Bcl-2表达下调[8]。本研究首先探讨金匮肾气汤对db/db小鼠肾脏足细胞的保护作用。结果显示，金匮肾气汤治疗db/db糖尿病小鼠12周后，24h尿白蛋白水平明显降低，但对血糖影响不明显，可能与动物模型相关，也提示金匮肾气汤对db/db小鼠的肾保护作用可能与血糖控制无关。PAS染色显示，金匮肾气汤治疗后，系膜基质增生程度减轻。免疫荧光提示，肾小球内Podocin呈线样分布、荧光强度增强。电镜检测结果显示，用金匮肾气汤治疗后，足细胞足突倒伏、足突融合明显好转，大部分足突呈指状分布在肾小球基底膜外。提示金匮肾气汤可改善db/db糖尿病小鼠肾脏足细胞损伤，从而延缓DN进展。
Bcl-2是一种众所周知的促存活基因，在包括足细胞在内的多种细胞系统中起重要作用[9]。Bcl-2主要通过与caspase等蛋白质的反馈系统，以及通过控制线粒体膜通透性，来调节细胞死亡[10-11]。其中，JNK1介导的Bcl-2磷酸化是调控细胞自噬和凋亡的基本通路。Bcl-2少量磷酸化可使Bcl-2/Beclin-1复合物分离，从而促进自噬，保护细胞存活；但当Bcl-2多位点磷酸化后，Bcl-2/Bax复合物被破坏，抗凋亡功能失活，caspase-3活化，caspase-3活化后被剪切成12ku和17ku的片段而发挥作用，导致凋亡发生[12-13]。在本实验中，我们观察到db/db小鼠肾皮质中JNK1磷酸化水平明显增高，Bcl-2磷酸化明显增加，活化后的caspase-3比正常对照组小鼠明显增高，提示凋亡增多；金匮肾气汤治疗后，db/db小鼠肾皮质中JNK1和Bcl-2磷酸化水平下调，活化的caspase-3片段明显减少，且金匮肾气汤组比二甲双胍组下调更明显。结果提示，金匮肾气汤可能通过JNK1/Bcl-2通路改善足细胞凋亡，从而保护足细胞。
综上所述，对JNK1/Bcl-2信号途径的调节可能是金匮肾气汤减少足细胞凋亡，从而延缓DN进展的机制之一。
( 致谢: 本研究在湖南中医药大学医学院实验室、湖南斯莱克景达实验动物有限公司、湘雅医院病理科完成，唐笑凤老师参与部分实验，在此致以衷心的感谢！)
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