2. 延边大学 医学院病理学教研室，吉林 延吉 133002;
3. 延边大学 吉林省科技厅重点实验室，吉林 延吉 133002
2. Dept of Pathology, Yanbian University Medical College, Yanji Jiling 133002, China;
3. Key Lab of the Science and Technology Dept of Jilin Province, Yanji Jiling 133002, China
胆管癌是源自胆管上皮细胞的恶性肿瘤，具有易发生转移、预后差等特点[1]。目前，其治疗手段以外科手术切除为主，辅以放化疗[2]，但常规放化疗方法具有毒副作用大、易耐药等缺点。近年来，分子靶向治疗是一种快速发展的治疗方法，可特异性的结合肿瘤细胞并诱导其凋亡，但不会伤及肿瘤周围的正常组织细胞，因此，分子靶向治疗也被称为“生物导弹”。
研究表明[3]，在胆管癌中，Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路异常激活，并与肿瘤的侵袭和转移等恶性进程呈正相关。mTOR在体内以mTORC1和mTORC2两种复合物的方式存在[4]。研究发现，mTORC1的特异性靶向药物雷帕霉素，易出现负反馈作用，导致Akt的磷酸化[5]。AZD8055是一种新型的mTORC1和mTORC2双重抑制剂(结构见Fig 1A)，能有效抑制mTORC1复合物引起的Akt负反馈活性。在肝癌、神经母细胞瘤等多种肿瘤中，AZD8055通过抑制细胞增殖和/或诱导细胞凋亡，从而达到抗肿瘤作用[6-8]，但在胆管癌中的抗肿瘤作用及其分子机制尚未见报道。
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| Fig 1 Effect of AZD8055 treatment on proliferation and colony of HuCCT1 cells (x±s, n=3) A: The molecular structure of AZD8055; B: Cell viability of HuCCT1 cells treated by AZD8055 was measured by MTT assay.#P < 0.05 vs 24 h control group; *P < 0.05 vs 48 h control group; △P < 0.05 vs 72 h control group; C:Colony formation assays were performed to detect changes in colony forming ability of HuCCT1 cells treated with AZD8055 and quantification of results.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
原癌基因DEK是一种染色质调节蛋白，在胆管癌中呈高表达[9]，可通过调节Akt/mTOR信号通路、转录因子等多种途径，促进肿瘤细胞生长、浸润等过程[10-11]，提示DEK可作为抗肿瘤的靶点。因此，本研究旨在探讨AZD8055对胆管癌细胞HuCCT1的抑制作用，阐明其分子机制，为胆管癌的临床治疗提供新的实验依据及理论基础。
1 材料 1.1 细胞株人胆管癌HuCCT1细胞，购自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)细胞库。
1.2 试剂AZD8055，购自美国Selleck Chemicals公司(批号:S1555)，用DMSO配制成1 mmol·L-1的浓缩液，分装保存于-20 ℃冰箱；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、Opti-MEM培养基，均购自美国Gibco公司；RPMI 1640培养基，购自美国Corning公司；p-4EBP1、4EBP1、p-S6、S6、p-Akt、Akt、上皮型钙黏蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、转录因子Snail抗体，均购自美国Cell Signaling Technology公司；DEK抗体，购自美国BD公司；β-actin抗体，购自美国Abcam公司；MTT、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，均购自美国Amresco；吉姆萨(Gimesa)染色液，购自日本Wako；DEK小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)试剂，购自广州市锐博生物科技有限公司；Lipo 3000购自美国Invitrogen。
1.3 仪器光学倒置相差显微镜、奥林巴斯BX53显微镜(日本Olympus公司)；全波长多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；凝胶成像仪、电泳仪(Bio-Rad公司)。
2 方法 2.1 细胞培养HuCCT1细胞用RPMI 1640完全培养液(含10% FBS和1%青-链霉素)培养，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中常规培养。
2.2 MTT实验取对数生长期的HuCCT1细胞，以5×103个(100 μL)接种于96孔板，实验设置对照组、AZD8055组(50、100、200、400 nmol·L-1)，每组设置6个平行孔。每组细胞培养24、72、120 h后，每孔加入100 μL MTT(1 g·L-1)溶液，继续培养4 h，小心吸弃上清，加入100 μL的DMSO充分振荡，用全波长分光光度计，在490 nm处检测吸光度(OD)值。AZD8055对HuCCT1细胞的生长抑制率=(1-用药组OD值/对照组OD值)×100%。
2.3 平板集落形成实验取对数生长期的HuCCT1细胞，以每孔100个的细胞密度接种于6孔板中，次日更换为完全培养液及分别含AZD8055(25、50、100 nmol·L-1)的培养液，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养14 d，肉眼可见含有50个以上的细胞集落时，用PBS缓冲液清洗2次，室温下4%多聚甲醛固定，Giemsa染液染色，自然干燥后，进行拍照，用ImageJ软件进行分析。
2.4 划痕愈合实验取对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%~ 90%融合后，用不含血清的培养液饥饿处理细胞6~8 h。用200 μL的灭菌枪头呈“1”字形进行划痕，PBS清洗后，对照组和用药组分别更换为完全培养液和浓度为100、200、400 nmol·L-1的AZD8055工作液，继续培养，在0、12 h拍照，记录划痕宽度，根据公式计算划痕愈合率:划痕愈合率=(0 h划痕宽度-12 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
2.5 Transwell小室迁移实验取对数生长期的HuCCT1细胞，用含1% FBS的培养液制备2×109·L-1的细胞悬液，取100 μL接种于Transwell小室中，待细胞贴壁后，上室分别加入用1% FBS配制的培养液及AZD8055工作液(100、200、400 nmol·L-1)，下室加入600 μL含10% FBS的完全培养液。继续培养24 h后，取出小室用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，双蒸水脱色，棉签擦净未迁移的细胞，将小室薄膜切下，铺于载玻片，封片，拍照观察并统计。
2.6 数据库分析登陆STITCH在线数据库(http://stitch.embl.de)，选择Multpile names，输入DEK基因及AZD8055，选择人类种属Homo Sapiens，确认信息后即可显示分析结果；登陆GeneMANIA在线数据库(http://www.genemania.org)，选择人类种属Homo Sapiens，输入DEK、Akt/mTOR信号通路的相关基因，确认信息后即可显示分析结果。
2.7 Western blot实验细胞常规培养，消化接种于60 mm培养皿，待细胞贴壁后，分别用AZD8055工作液(0、100、200、400 nmol·L-1)处理24 h后提取总蛋白，待检测Akt/mTOR信号通路及DEK蛋白；常规细胞培养，用AZD8055(0、400 nmol·L-1)分别处理0、6、12、24 h后提取总蛋白，待检测EMT相关蛋白。收集各组细胞，用TEPER裂解液提取总蛋白，BSA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，取40 μg蛋白行8%~10% SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入一抗(1 : 1 000)4 ℃孵育过夜，次日，洗膜，加HRP标记二抗(1 : 3 000)室温孵育2 h，ECL法显影、曝光，用ImageJ软件进行分析。
2.8 siRNA基因沉默实验取对数生长期的细胞接种于6孔板，分别设control组、negative control(NC)组及si-DEK组，次日待细胞生长至30%~50%，control组加入2 mL正常完全培养液，negative control组与si-DEK组分别加入含2 mL混合液(含1.74 mL的无双抗有血清RPMI 1640培养液、250 μL Opti-MEM培养基、5 μL的Lipo 3000和5 μL的50 nmol·L-1的siRNA)，继续培养48 h，待确认沉默效果后，进行MTT实验、划痕愈合实验、Transwell小室迁移实验、Western blot实验。本文使用的有效siRNA序列为siDEK4(5′-TGTCCTCATTAAAGAAGA A-3′)。
2.9 统计学方法采用SPSS 17.0和GraphPad Prism5.0软件进行统计分析，实验数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。每组实验均重复3次以上。
3 结果 3.1 AZD8055明显抑制胆管癌细胞增殖活力与集落形成能力MTT结果显示(Fig 1B)，与对照组相比，AZD8055(50、100、200、400 nmol·L-1)组细胞增殖活性明显受到抑制，且呈时间-浓度依赖性(P＜0.05)。平板集落形成实验结果提示(Fig 1C)，AZD8055处理HuCCT1细胞14 d后，与对照组相比，AZD8055(25、50、100 nmol·L-1)组细胞克隆形成能力明显减弱，且呈剂量依赖性(P＜0.05)，提示AZD8055可明显抑制HuCCT1细胞的增殖活性。
3.2 AZD8055抑制胆管癌细胞的迁移能力Fig 2A的划痕愈合实验结果发现，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用细胞12 h后，与对照组相比，药物处理组细胞横向迁移距离明显缩短。Fig 2B的Transwell实验结果发现，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)处理HuCCT1细胞24 h后，其纵向细胞迁移能力明显受到抑制(P＜0.05)，提示AZD8055可抑制胆管癌细胞的横向及纵向迁移能力。
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| Fig 2 Influence of AZD8055 on HuCCT1 cell migration (x±s, n=3) A: Wound-healing assay(×100) and quantification of results; B: Transwell assay(×200) and quantification of results.**P < 0.01 vs control group. |
Western blot结果显示，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用于胆管癌细胞24 h后，Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化水平明显下降(Fig 3A)。经400 nmol·L-1的AZD8055处理6、12、24 h后，上皮标志物E-cadherin蛋白表达升高，间质标志物Vimentin、Snail蛋白表达下降(Fig 3B)，提示AZD8055抑制Akt、S6、4EBP1的磷酸化水平及EMT进程。
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| Fig 3 Blockade of Akt/mTOR pathway and processof EMT by AZD80055 in HuCCT cells (x±s, n=3) A: Expression of p-Akt, Akt, p-S6, S6, p-4EBP1 and 4EBP1 was detected in AZD8055-treated HuCCT cells by Western blot; B: Expression of E-cadherin, Vimentin, Snail was detected in 400 nmol·L-1 AZD8055-treated HuCCT cells at 0, 6, 12, 24 h. |
为了检测AZD80055抑制胆管癌细胞的增殖和迁移的机制，用STITCH数据库分析AZD8055与DEK蛋白之间的相关性(Fig 4A)。STITCH数据库分析结果显示，AZD8055与DEK蛋白之间具有相关性。以上提示，DEK蛋白可作为AZD8055与Akt/mTOR信号通路的枢纽蛋白，参与AZD8055抑制胆管癌细胞HuCCT1的增殖、迁移及EMT进程的调控过程。
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| Fig 4 Proliferation and migration of cholangiocarcinoma cells inhibited by AZD8055 via regulating DEK gene (x±s, n=3) A: Network of AZD8055/DEK interactions; B: Expression of DEK was detected in AZD8055-treated HuCCT cells; C: Screening DEK gene by Western blot; D: Cell viability of HuCCT1 after DEK silencing for 24 h was measured by MTT assay; E: Wound-healing assay(×100) and quantification of results; F: Transwell assay(×200) and quantification of results.**P < 0.01 vs control group. CON:control; NC:negative control. |
Western blot结果发现，AZD8055(100、200、400 nmol·L-1)作用于胆管癌细胞24 h后，DEK蛋白表达明显受到抑制(Fig 4B)，表明AZD8055可调控DEK蛋白的表达，与STITCH数据库结果一致。筛选DEK基因沉默序列，结果表明，si-DEK4沉默效果最为明显(Fig 4C)，后续实验选择si-DEK4作为沉默序列。基因沉默48 h后，胆管癌细胞的增殖能力与迁移能力明显受到抑制(P＜0.05)(Fig 4D~4F)，提示AZD8055可靶向DEK蛋白，抑制胆管癌的增殖与迁移。
3.5 AZD8055靶向DEK调控Akt/mTOR信号通路抑制胆管癌细胞的EMT进程为了检测DEK与Akt/mTOR信号通路之间的关系，用GeneMANIA数据库分析DEK与Akt/mTOR信号通路之间的相关性(Fig 5A)。GeneMANIA数据库分析结果提示，DEK与Akt/mTOR信号通路存在明显的相关性。
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| Fig 5 AZD8055 targets DEK to regulate Akt/mTOR signaling pathway to inhibit EMT progress of cholangiocarcinoma cells (x±s, n=3) A: Network of DEK/Akt/mTOR pathway interactions; B: Expression of p-Akt, Akt, p-S6, S6, p-4EBP1 and 4EBP1 was detected in siDEK4-treated HuCCT cells; C: Expression of E-cadherin, Vimentin, Snail was detected in siDEK4-treated HuCCT cells. CON:control; NC:negative control. |
Western blot结果显示，DEK基因沉默48 h后，Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化表达水平明显下调(Fig 5B)，且上皮标志物E-cadherin表达上调，间质标志物Vimentin、Snail表达下调(Fig 5C)。上述结果提示，AZD8055靶向DEK，抑制Akt/mTOR信号通路的磷酸化水平，并抑制胆管癌细胞的EMT进程。
4 讨论胆管癌是消化道恶性程度较高的肿瘤，死亡率居高不下[1]。多项研究证实，AZD8055可作为一种新型抗肿瘤药物，通过抑制增殖与诱导凋亡，达到良好的体内外抗肿瘤作用[4, 12]。本实验通过MTT法检测AZD8055对胆管癌细胞HuCCT1增殖的影响，结果显示，不同浓度的AZD8055能够有效抑制胆管癌的增殖活性，呈剂量-时间依赖性；进一步的克隆结果显示，AZD8055可以明显减少HuCCT1细胞的集落数量。李鹏等[7]的研究表明，AZD8055可以通过调节AMPK蛋白的磷酸化水平，抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成能力。划痕愈合实验和Transwell小室迁移实验结果显示，AZD8055明显抑制胆管癌细胞的横向与纵向迁移能力。这与Giubellino等[13]的研究中，AZD8055可以通过Akt/mTOR信号通路，抑制嗜铬细胞瘤迁移能力的结果相一致。
Akt/mTOR信号通路是肿瘤发生的一个重要信号通路，在多种肿瘤中异常激活[14]，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、自噬与转移等过程密切相关。Western blot结果显示，AZD8055处理细胞后，Akt、S6和4EBP1的蛋白磷酸化水平均受到明显抑制，提示AZD8055可通过抑制Akt/mTOR信号通路，调控HuCCT1细胞的凋亡、增殖和迁移。
DEK作为一种原癌基因参与多种生物进程，如增殖、衰老、凋亡、分化和转化蛋白。通过STITCH数据库分析结果显示，AZD8055与DEK蛋白之间具有相关性。进一步的GeneMANIA数据库发现，DEK与Akt/mTOR信号通路存在交互关系。本实验结果表明，不同浓度AZD8055处理HuCCT1细胞24 h后，可明显抑制DEK蛋白的表达水平，而沉默DEK基因明显抑制了Akt、S6、4EBP1蛋白的磷酸化表达水平，并明显降低胆管癌细胞增殖及迁移。Wu等[11]研究证实，下调DEK基因抑制胰腺导管癌的增殖和转移，与我们的研究结果相符。本课题组前期的研究证实，DEK作为Akt的上游因子，参与和调控Akt信号通路[9]。
EMT是指上皮细胞失去细胞极性向间质细胞表型转化的现象。当细胞发生癌变时，上皮细胞间的细胞连接减弱，从而促进细胞迁移和侵袭能力。Nörz等[15]的研究结果发现，AZD8055联合MK-2206可抑制Akt/mTOR信号通路的活性，从而抑制黑色素瘤细胞的EMT进程。本研究结果也显示，胆管癌细胞经AZD8055处理后，E-cadherin表达上调，Vimentin、Snail表达下调。Yang等[16]的研究证明，沉默乳腺癌细胞中的DEK基因后，E-cadherin表达上调，Vimentin、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP-2和MMP-9表达下调。本实验结果表明，当HuCCT1细胞中DEK基因沉默后，上皮标志物E-cadherin表达上调，间质标志物Vimentin、Snail表达下调。
综上所述，AZD8055可有效抑制HuCCT1胆管癌细胞的迁移及EMT进程，这与降低DEK蛋白表达水平，抑制Akt/mTOR信号通路相关。本研究将为AZD8055应用于胆管癌的临床治疗提供新的理论依据。
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