骨形态发生蛋白9(bone morphorgenetic protein 9，BMP9)作为BMP家族中研究较少的成员，是有效诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)骨向分化的因子之一[1]。因此，BMP9可能具有良好的临床应用前景，用于治疗骨质疏松、骨缺损、骨不连接等骨相关疾病。迄今为止，BMP9诱导MSCs骨向分化的具体分子机制仍不十分清楚。
作为TGF-β家族的一员，BMP9本身参与多种生理过程，如调节胆碱能神经元发育、铁代谢与血管生成，以及促进MSCs向成骨细胞系定向分化[2]等。BMP9可以通过经典BMP/Smad途径发挥其生理功能，此外，BMP9也可以通过非经典BMP/Smad途径发挥作用，如p38 MAPK和PI3K/Akt途径等[3]。研究报道，多种其他信号或因子能够参与调节BMP9诱导的MSCs成骨分化，如生长激素(growth hormone，GH)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、维甲酸、Wnt/β-catenin及Notch信号[4]。BMP9虽能诱导MSCs骨向分化，但同时也伴有成脂分化[5]。因此，降低BMP9诱导MSCs的成脂分化可能是增强其诱导MSCs成骨分化的有效措施之一。
Wnt/β-catenin信号是调节细胞增殖分化的重要信号之一[6]。据报道，BMP9在诱导MSCs成骨分化的过程中能增强Wnt/β-catenin信号的活性，沉默β-catenin则减弱BMP9诱导MSCs成骨分化的能力[7]。但BMP9在诱导MSCs成骨分化过程中调节Wnt/β-catenin信号的机制尚不清楚。Wnt10b是Wnt/β-catenin信号的一种配体，对前脂肪细胞的分化有抑制作用，但能促进成骨分化[8]。因此，Wnt10b可能对BMP9诱导的MSCs成骨分化具有促进作用，尽管两者的关系目前还不清楚。本研究在前期工作基础上，分析Wnt10b在BMP9诱导MSCs成骨分化中的作用及其可能的分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物实验所用NIH孕鼠(E12.5)，购自于重庆医科大学实验动物中心，并代养于SPF级饲养室内。
1.1.2 细胞及细胞培养小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，从NIH小鼠12.5 d胚胎中提取获得；人肾上皮细胞HEK293、间充质干细胞C3H10T1/2、成肌细胞C2C12及小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1，购自ATCC(Manassas，VA，USA)。采用高糖DMEM(含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、0.1 g·L-1链霉素)进行细胞培养，培养条件为5% CO2及37 ℃。
1.1.3 试剂一抗Wnt10b(ab155332)、环氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)(ab15191)、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB)(ab32096)，购自Abcam公司；一抗GAPDH(sc-32233)、骨桥素(osteopontin，OPN)(sc-10593)、骨钙素(osteocalcin，OCN)(sc-18319)、重组人CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α，C/EBPα)(sc-61)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)(sc-1984)、Smad1/5/8(sc-6031-R)、p-Smad1/5/8(sc-12353)，购自Santa Cruz Biotechnology公司。
1.1.4 仪器细胞培养箱、低温离心机(Thermo公司)；超净操作台(安泰技术有限公司)；倒置荧光显微镜(日本Nikon)；湿式转膜仪、垂直电泳槽(六一仪器厂)；凝胶成像仪(Bio-Rad公司)。
1.2 重组腺病毒的构建及转染本实验所用重组腺病毒采用Ad-Easy系统进行构建[9]。利用PCR扩增BMP9、Wnt10b、绿色荧光蛋白(GFP)的编码序列，将所获片段以及Wnt10b的小干扰RNA片段克隆到腺病毒穿梭载体中，然后将穿梭质粒与AdEasy-1在BJ5183细菌中重组。最后，将重组好的质粒线性化，并转化到HEK293细胞中包装重组腺病毒。所获重组腺病毒载体分别命名为AdBMP9、AdWnt10b、AdGFP、AdsiWnt10b[10]，其中，GFP用于标记腺病毒载体，AdGFP作为载体对照。
1.3 流式细胞术周期分析将C3H10T1/2细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，根据实验设计要求，分别用不同的重组腺病毒(AdGFP、AdBMP9、AdWnt10b及AdBMP9合并AdWnt10b)处理细胞。48 h后收集细胞，用冰PBS(4 ℃)重悬细胞并离心(800 r·min-1, 5 min×2次)。然后用预冷的70%、50%、30%乙醇固定，并用PBS洗涤。加入1 mL PI(20 g·L-1)溶液(含RNase，1 g·L-1)孵育30 min。最后用流式细胞仪进行周期分析。每组实验重复3次。
1.4 Real-time PCR实验利用TRIzol试剂裂解细胞并提取总RNA，通过逆转录反应得到cDNA。将所得cDNA稀释5~10倍，作为模板用于定量PCR检测。以GAPDH的表达水平对目的基因的表达进行标准化。本实验所涉及到引物序列见Tab 1。
| Gene | Primer sequence(5′→3′) |
| GAPDH | F:ACCCAGAAG ACTGTGGATGG |
| R:CACATTGGGGGTAGGAACAC | |
| Runx2 | F:GCCGGGAATGATGAGAACTA |
| R:GGACCGTCCACTGTCACTTT | |
| Wnt10b | F:GGATGGAAGGGTAGTGGTGA |
| R:CTCTCCG AAGTCCATGTCGT |
将细胞接种于6孔板中，根据实验设计利用重组腺病毒以及其他试剂处理。在预定的时间点，裂解细胞，并将裂解液煮沸10 min使裂解物变性。所得样品在SDS-PAGE胶中分离，并转移到PVDF膜上，以10%脱脂奶粉封闭，以相应的一抗和二抗分别孵育。最后利用超敏ECL化学发光试剂测定靶蛋白表达情况。每组实验重复3次。
1.6 矿物质沉积实验将细胞接种于24孔板中，并根据实验设计用相应重组腺病毒及其他试剂处理。21 d后，弃培养基并用PBS洗涤3次，室温下加入0.05%戊二醛固定10 min，用蒸馏水洗涤。然后以0.4%茜素红S溶液对细胞进行染色5 min，用蒸馏水轻轻洗涤。观察矿物质沉淀。扫描平板，并在显微镜下采集图像。每组实验重复3次。
1.7 油红O染色将细胞接种到24孔板中，根据实验设计用重组腺病毒及其他相应试剂处理细胞。14 d后，先用10%福尔马林固定细胞30 min，然后弃固定液并用PBS洗涤3次，最后用油红O溶液染色，在显微镜下采集图像。定量分析时，用异丙醇从细胞中提取油红O，在570 nm处测定吸光度值。每组实验重复3次。
1.8 统计学分析实验数据表示为x±s。用GraphPad Prism 6软件进行统计学分析。采用双尾t检验进行两组间比较。采用Tukey检验的单因素方差分析(ANOVA)进行多组间比较。
2 结果 2.1 BMP9在干细胞中对Wnt10b表达的影响Wnt10b是经典Wnt/β-cantein信号的一种配体。课题组前期研究表明，BMP9能够促进MSCs的成骨分化，但BMP9与Wnt10的关系尚不清楚。因此，本研究旨在探讨Wnt10b是否参与调节BMP9诱导MSCs成骨分化的作用。首先检测在MSCs中，BMP9对Wnt10b表达的影响。结果显示，BMP9在C3H10T1/2细胞及3T3-L1细胞中能上调Wnt10b的mRNA水平(Fig 1A、1B)，并且增加C3H10T1/2细胞中Wnt10b的蛋白表达水平(Fig 1C)。此外，Wnt10b在C3H10T1/2、C2C12、MEFs和MC3T3-E1等细胞中均有表达(Fig 1D)。以上结果提示，Wnt10b可能在BMP9诱导MSCs成骨分化过程中起重要调节作用。
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| Fig 1 Effect of BMP9 on expression of Wnt10b in stem cells (x±s, n=3) A: Real-time PCR assay results showed the effect of BMP9 on the mRNA level of Wnt10b in C3H10T1/2 cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; B: Real-time PCR assay results showed the effect of BMP9 on the mRNA level of Wnt10b in 3T3-L1 cells; C: Western blot assay results showed the effect of BMP9 on the protein level of Wnt10b; D: Real-time PCR assay results showed the mRNA level of Wnt10b in C3H10T1/2, C2C12, MEFs, 3T3-L1, MC3T3-E1 cells. |
BMP9可在C3H10T1/2细胞中上调Wnt10b表达。因此，本研究接下来分析Wnt10b是否可以增强BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的能力。定量PCR检测结果显示，BMP9能够上调Dlx-5 mRNA的表达水平，Wnt10b也能增加Dlx-5 mRNA的表达水平，并明显增强BMP9上调Dlx-5表达的能力(Fig 2A)。Western blot结果显示，BMP9增加C3H10T1/2细胞中OPN和OCN的蛋白水平，Wnt10b对OPN和OCN的蛋白水平没有明显影响，但能明显增强BMP9对OPN和OCN表达的促进作用(Fig 2B)。同时，Wnt10b还能明显增强BMP9诱导MSCs矿物质沉积的能力(Fig 2C)。沉默Wnt10b不仅降低Dlx-5 mRNA水平，也减弱BMP9上调Dlx-5表达的能力(Fig 2D)，沉默Wnt10b也减弱BMP9上调OPN和OCN蛋白水平的作用(Fig 2E)。矿化实验结果也显示，沉默Wnt10b能减弱BMP9在C3H10T1/2细胞中矿化的能力(Fig 2F)。以上结果提示，Wnt10b可能是促进BMP9诱导MSCs成骨分化的重要调节因子。
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| Fig 2 Effect of Wnt10b on BMP9-induced osteogenic markers in C3H10T1/2 cells (x±s, n=3) A: Real-time PCR assay results showed the effect of Wnt10b on the mRNA levels of BMP9-induced Dlx-5 in C3H10T1/2 cells; B: Western blot assay results showed the effect of Wnt10b on the protein levels of BMP9-induced OPN and OCN in C3H10T1/2 cells; C: Alizarin red staining assay results showed the effect of Wnt10b on BMP9-induced mineral deposition in C3H10T1/2 cells; D: Real-time PCR assay results showed the effect of siWnt10b on the mRNA levels of BMP9-induced Dlx-5 in C3H10T1/2 cells; E: Western blot assay results showed the effect of siWnt10b on the protein levels of BMP9-induced OPN and OCN in C3H10T1/2 cells; F: Alizarin red staining assay results showed the effect of siWnt10b on BMP9-induced mineral deposition in C3H10T1/2 cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs AdBMP9. |
为分析Wnt10b促进BMP9诱导干细胞骨向分化的机制，本研究分析了Wnt10b与BMP9对细胞周期的影响。流式分析结果显示，BMP9及Wnt10b均不影响细胞的周期(Fig 3A)。Western blot分析也显示，BMP9及Wnt10b均不明显影响PCNA的蛋白水平(Fig 3B)。以上结果提示，Wnt10b促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化可能与影响增殖能力无关。
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| Fig 3 Effect of BMP9 and Wnt10b on cell cycle in C3H10T1/2 cells (x±s, n=3) A: Flow cytometry analysis results showed the effect of BMP9 and Wnt10b on proliferation of C3H10T1/2 cells; B: Western blot assay results showed the effect of BMP9 and Wnt10b on the protein level of PCNA in C3H10T1/2 cells, GAPDH was used as loading control. |
BMP9可通过经典BMP/Smad途径或非经典BMP/Smad途径发挥其生理功能。因此，本研究进一步检测Wnt10b促进BMP9诱导干细胞成骨分化，是否与影响BMP/Smad信号的活性有关。Western blot结果显示，BMP9对Smad1/5/8水平无明显影响，但能明显增加Smad1/5/8的磷酸化水平。Wnt10b对p-Smad1/5/8和Smad1/5/8的水平无明显影响，但能明显增强BMP9对Smad1/5/8磷酸化的促进作用(Fig 4A、4B)。沉默Wnt10b对p-Smad1/5/8和Smad1/5/8的水平也无明显影响，但能明显降低BMP9对Smad1/5/8磷酸化的促进作用(Fig 4C、4D)。以上结果提示，Wnt10b促进BMP9诱导干细胞成骨分化的作用可能与增强BMP/Smad信号的转导活性有关。
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| Fig 4 Effect of Wnt10b on BMP9-induced BMP/Smad signaling (x±s, n=3) A: Western blot assay results showed the effect of Wnt10b on the levels of BMP9-mediated p-Smad1/5/8; B: Quantification results of Western blot showed the effect of Wnt10b on the levels of BMP9-mediated p-Smad1/5/8; C: Western blot assay results showed the effect of siWnt10b on BMP9-mediated p-Smad1/5/8 levels; D: Quantification results of Western blot showed the effect of siWnt10b on BMP9-mediated p-Smad1/5/8 levels.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs AdBMP9. |
干细胞的成骨分化和成脂分化是两个相互影响的生理过程，脂肪生成增加可能导致骨形成减少。据报道，Wnt10b可以抑制前脂肪细胞分化。因此，我们推测Wnt10b也可能通过抑制BMP9介导的MSCs成脂分化，从而增强BMP9的成骨分化诱导能力。油红O染色结果显示，Wnt10b明显降低BMP9诱导C3H10T1/2细胞成脂分化的能力(Fig 5A、5B)。Western blot结果显示，BMP9上调C/EBPα和PPARγ的蛋白水平，但Wnt10b能明显减弱BMP9增加C/EBPα和PPARγ水平的作用(Fig 5C)。沉默Wnt10b能促进干细胞向脂肪细胞分化，同时明显增强BMP9诱导的脂滴形成(Fig 5D、5E)，并且增强BMP9上调C/EBPα和PPARγ蛋白水平的能力(Fig 5F)。以上结果提示，Wnt10b对BMP9诱导干细胞成骨分化的作用可能部分与抑制BMP9诱导干细胞成脂分化有关，但具体机制有待进一步深入研究。
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| Fig 5 Effect of Wnt10b on BMP9-induced adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells (x±s, n=3) A: Oil red O staining assay results showed the effects of Wnt10b on BMP9-induced adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells; B: Quantification results of Oil red O staining showed the effects of Wnt10b on BMP9-induced adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells; C: Western blot assay results showed the effect of Wnt10b on BMP9-induced protein levels of C/EBPα and PPARγ in C3H10T1/2 cells; D: Oil red O staining assay results showed the effects of siWnt10b on BMP9-induced adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells; E: Quantification results of Oil red O staining showed the effects of siWnt10b on BMP9-induced adipogenic differentiation of C3H10T1/2 cells; F: Western blot assay results showed the effect of siWnt10b on BMP9-induced protein levels of C/EBPα and PPARγ in C3H10T1/2 cells.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs AdBMP9. |
本研究分析了Wnt10b对BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的影响，以及调节该过程的可能分子机制，首次提出Wnt10b增强BMP9诱导成骨分化的能力可能与增强BMP/Smad信号的转导活性有关，并且进一步探索了其对BMP9成脂诱导分化能力的影响，为进一步揭示Wnt信号通路与BMP/Smad通路之间的关系提供实验基础。结果发现，BMP9能上调Wnt10b的表达，Wnt10b能明显促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的能力；Wnt10b的这种作用可能与增强BMP/Smad信号的传导，同时抑制BMP9诱导干细胞的成脂分化有关。
BMP属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员，是调节细胞多种重要生理过程的关键因子，如细胞的增殖和分化[4]。虽然BMP9(也称为GDF2)最开始是从小鼠肝脏的cDNA文库中鉴定，但其具有多种生理功能，包括调节胆碱能神经元的发育、铁代谢、血管生成，以及促使MSCs向成骨细胞系的定向分化等[1-2]。据报道，BMP9的成骨分化诱导能力可能强于BMP2和BMP7。因此，BMP9可能是最有效的诱导干细胞成骨分化的BMPs因子之一[1]。BMP9通常通过BMP/Smad途径(即经典BMP/Smad途径)或非经典BMP/Smad途径(如p38 MAPKs和PI3K/Akt途径)发挥其生理功能[3]。在经典的BMP/Smad途径中，BMP9与其膜受体结合，并激活Smad1/5/8(即p-Smad1/5/8)。然后，p-Smad1/5/8募集并磷酸化Smad4以形成复合物。最后，复合物易位到细胞核中，调节下游靶基因表达。此外，有研究表明，多种其他因子或信号也参与调节BMP9诱导的干细胞成骨分化，如GH、IGF、维甲酸和Wnt/β-catenin信号[3-4]。但BMP9诱导干细胞成骨分化的具体分子机制尚不十分清楚。
成骨和成脂分化是两个相互影响的过程[11]。MSCs通常以成脂分化的减少为代价，向成骨细胞谱系分化，反之亦然。尽管BMP9在MSCs中显示出强大的诱导成骨分化的能力，但它也可诱导干细胞向脂肪细胞分化[12]。因此，可以通过减弱MSCs中的成脂分化，来增强BMP9的促成骨能力。Wnt/β-catenin是调节细胞分化、增殖和存活的重要信号。研究表明，Wnt信号对骨骼系统和脂肪的形成也非常重要[13]。异常的Wnt/β-catenin信号与多种骨相关疾病有关，如骨质疏松症、骨关节炎、骨硬化症等。据报道，BMP9在诱导MSCs成骨分化时可激活Wnt/β-catenin信号，沉默β-catenin或过表达DKK1均能降低BMP9的促成骨潜能，而过表达β-catenin则增强BMP9的促成骨能力[14]。因此，BMP9诱导干细胞成骨分化作用与Wnt/β-catenin信号关系密切。
Wnt10b是Wnt/β-catenin信号的另一种经典蛋白质。有研究表明，Wnt10b与免疫系统的调节有关[15]。此外，Wnt10b可以促进成骨分化，并抑制前脂肪细胞的分化。因此，课题组推测，Wnt10b可能参与调节BMP9诱导的成骨分化。本研究结果显示，BMP9可以上调C3H10T1/2细胞和其他几种干细胞中Wnt10b的表达；Wnt10b能增加BMP9诱导的MSCs成骨指标水平，但沉默Wnt10b则降低BMP9的这种作用。提示Wnt10b对BMP9诱导MSCs的成骨分化具有重要促进作用。研究进一步发现，Wnt10b明显增加由BMP9介导的Smad1/5/8磷酸化水平，而沉默Wnt10b减弱BMP9对p-Smad1/5/8的促进作用。同时，Wnt10b可降低BMP9在C3H10T1/2细胞中上调PPARγ和C/EBPα水平的作用，并减少细胞中脂滴的形成；沉默Wnt10b增强BMP9在C3H10T1/2细胞中诱导的脂肪分化。
综上所述，本研究的结果表明，Wnt10b可以促进BMP9诱导MSCs的成骨分化，这种作用可能与增强BMP/Smad信号的传导活性，以及抑制BMP9诱导MSCs成脂分化有关。
( 致谢: 本研究在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成，感谢何通川教授(T. C. HE，芝加哥大学医学中心)为本实验馈赠所需的重组腺病毒载体。)
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