2. 贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025;
3. 贵州中医药大学 第一附属医院风湿免疫科，贵州 贵阳 550025
2. College of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China;
3. Rheumatology and Immunology Dept, the First Affiliated Hospital, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)属自身免疫病，以滑膜炎性增生为表现，易致关节肿胀，关节软骨受损伴畸形，初期临床治疗多以积极抗炎治疗，阻止患者关节骨质的破坏，降低致残率。随着对自身免疫性疾病治疗药物的深入研究和对作用靶点的挖掘，如白介素类单克隆抗体、信号通路靶向抑制类药物、生物碱类、多糖类、黄酮类天然药物等，已被开发并部分上市应用临床[1]。异绿原酸A(isochlorogenic acid A)作为奎宁酸与咖啡酸酯化缩合下的天然产物，多存在于忍冬藤、黑骨藤、金银花等植物中，具有一定的抗氧化、抗过敏、抗菌等作用[2]。但有关异绿原酸A对RA药效和机制未有深入报道，本研究拟通过制备胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，考察异绿原酸A对类风湿关节炎动物模型干预后表现及其潜在抗炎分子机制，为异绿原酸A的开发应用提供资料。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物SPF级SD大鼠，♂，体质量(200±20)g，购自长沙天勤生物技术有限公司，动物饲养合格证编号为43000200003443。
1.1.2 药物与试剂异绿原酸A(纯度99%)，购自成都德思特生物技术有限公司；白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、肿瘤坏死因子ɑ(tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ)、C反应蛋白(C reaction protein，CRP)、干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)、白细胞介素18(interleukin 18，IL-18)试剂盒，均购自上海通蔚生物科技有限公司；NLRP3抗体(ab214185)、caspase-1抗体(ab1872)、NF-κB p65抗体(ab16502)、核因子κB活化因子受体配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)抗体(ab239607)、β-actin抗体(ab8226)，均购自Abcam公司；p-NF-κB p65抗体(#3031)、磷酸化核因子κB抑制蛋白ɑ(p-IκB-α)抗体(#2859)，均购自CST公司；完全弗氏佐剂，购自Sigma公司；牛Ⅱ型胶原，购自Chondrex公司；生物素标记山羊抗兔抗体、ECL发光液、苏木精-伊红染色试剂盒，均购自上海碧云天生物技术有限公司；MinuteTM动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒，购自北京英文特生物技术有限公司；微量BCA蛋白定量试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.1.3 仪器石蜡病理切片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)；电泳仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；数显百分测厚仪(河南华方信息技术有限公司)；电子显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。
1.2 方法 1.2.1 CIA大鼠模型的制备SPF级SD大鼠随机分为正常组10只和造模组若干只，根据参考文献造模方式[3-4]，造模前，将胶原与完全弗氏佐剂1 : 1混合成乳剂后冰上备用，造模组分别在d 0和d 7尾根部皮下多点注射乳剂0.2 mL，肉眼观察大鼠足趾致炎情况，按评分标准进行模型筛选:0分为双足跖趾无红肿；1分为双足跖趾轻度肿胀；2分为双足跖趾中度肿胀；3分为双足跖趾重度肿胀；4分为足跖趾、踝关节全部肿胀或伴有畸形。评分1分以上即可则随机入组。制备模型成功的大鼠继续随机分配为模型组和异绿原酸A(50、100 mg·kg-1)组，每组10只。之后4组分别灌胃蒸馏水10 mL·kg-1和异绿原酸A 50或100 mg·kg-1，每天1次，连续给药42 d。给药期间动物无死亡，正常饮水饮食，符合贵州中医药大学动物伦理规范。动物称重并测量每组大鼠足跖肿胀厚度后，处死取血；取骨关节，4%多聚甲醛固定；取关节滑膜组织，-80 ℃超低温保存。
1.2.2 足跖部肿胀度测量记录厚度测量仪测量大鼠双后肢诱导前和诱导后每周肿胀度，记录并统计分析。肿胀度=诱导后厚度-诱导前厚度。
1.2.3 脾脏脏器系数检测解剖脾脏称重，记录并计算脏器系数:脾脏系数=脾脏重量÷大鼠体质量。
1.2.4 HE染色观察骨关节病理改变骨关节组织常规脱钙，脱钙完全后自来水冲洗，70%、80%、90%、100%乙醇浸泡24 h，二甲苯浸泡12 h，液体石蜡浸泡12 h，包埋并切片，厚度10 μm，新鲜的二甲苯脱蜡20 min，100%、90%、80%、70%乙醇浸泡10 min，蒸馏水浸泡1 min，苏木精染色10 min，自来水冲洗5 min，伊红染色1 min，70%、90%乙醇浸泡10 min，二甲苯浸泡10 min，盖玻片封片，镜下观察并记录。
1.2.5 免疫蛋白印迹法检测关节滑膜内蛋白表达根据试剂盒说明，提取关节滑膜总蛋白后，BCA法蛋白定量。按试剂盒操作步骤制备浓度12%分离胶和浓度5%浓缩胶，80 V电压电泳2 h后，60 V电压转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加一抗β-actin(1 : 6 000)、NLRP3(1 : 300)、caspase-1(1 : 2 500)，以及NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-ɑ、RANKL(1 : 500)，4 ℃孵育过夜后，加入二抗(1 : 10 000)，室温孵育2 h，TBST冲洗3次，ECL显影液显影，分析结果。
1.2.6 ELISA法检测血浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18水平取大鼠血浆，3 000 r·min-1离心15 min，取上层并根据试剂盒要求，制定好标准曲线后，按试剂盒操作步骤进行。
1.2.7 数据处理采用SPSS 20.0统计学软件对数据显著性分析，组间比较采用F检验进行数据分析。
2 结果 2.1 异绿原酸A对大鼠足跖炎性肿胀度的影响Tab 1结果表明，与正常组比较，模型组大鼠足跖肿胀程度明显增大(P < 0.01)。异绿原酸A(50、100 mg·kg-1)组大鼠足跖肿胀程度明显减轻，与模型组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。
| Group | Dose/mg·kg-1 | Week 1 | Week 2 | Week 3 | Week 4 | Week 5 | Week 6 | |||||||||||
| Left | Right | Left | Right | Left | Right | Left | Right | Left | Right | Left | Right | |||||||
| Control | - | 0.24±0.12 | 0.34±0.18 | 0.21±0.08 | 0.27±0.22 | 0.40±0.18 | 0.21±0.26 | 0.48±0.72 | 0.29±0.22 | 0.56±0.21 | 0.39±0.25 | 0.45±0.17 | 0.34±0.25 | |||||
| Model | - | 2.45±0.42** | 2.87±0.0.59** | 2.64±0.15** | 3.31±0.60** | 2.66±0.59** | 3.34±0.23** | 3.78±0.18** | 3.53±0.41** | 3.72±0.17** | 3.86±0.09** | 3.78±0.07** | 3.93±0.29** | |||||
| Isochlorogenicacid A | 50 | 2.08±0.21 | 2.72±0.26 | 2.58±0.19 | 2.88±0.54 | 2.58±0.31 | 3.02±0.22 | 2.74±0.41## | 2.88±0.45## | 2.75±0.11## | 2.86±0.28## | 2.79±0.11## | 2.81±0.14## | |||||
| 100 | 2.42±0.74 | 2.66±0.54 | 2.45±0.16 | 2.89±0.56 | 2.85±0.31 | 2.93±0.52 | 2.54±0.30## | 2.53±0.35## | 2.67±0.25## | 2.63±0.25## | 2.67±0.21## | 2.66±0.33## | ||||||
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model | ||||||||||||||||||
Fig 1结果显示，与正常组相比，模型组大鼠脾脏系数增加，差异具有统计学意义(P < 0.05)。不同剂量异绿原酸A可降低模型大鼠的脾脏系数。
|
| Fig 1 Effect of isochlorogenic acid A on spleen organ coefficient in rats (x±s, n=10) *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs model |
Fig 2的HE染色结果显示，正常组骨关节面光滑，软骨细胞排列整齐紧密，关节间隙良好，无赘生物生成。模型组骨关节面消失，软骨细胞排列紊乱，关节间隙消失并融合。给予不同剂量的异绿原酸A可明显抑制骨关节损伤的病理改变。
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| Fig 2 Effect of isochlorogenic acid A on pathology of bone and joint in rats by HE staining (scale bar=100 μm) A: Control; B: Model; C: Isochlorogenic acid A 50 mg·kg-1; D: Isochlorogenic acid A 100 mg·kg-1. |
Fig 3结果显示，与正常组相比，模型组NLRP3、caspase-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-α、RANKL蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P < 0.01)。与模型组相比，不同剂量异绿原酸A可降低模型大鼠上述蛋白表达(P < 0.01)。
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| Fig 3 Effect of isochlorogenic acid A on expression of NLRP3, caspase-1, NF-κB p65, p-NF-κB p65, p-IκB-α, RANKL in rats synovium (x±s, n=10) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs model |
Tab 2结果显示，与正常组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18表达升高。与模型组比较，不同剂量异绿原酸A对血浆中IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18表达均呈抑制作用，差异具有统计学意义(P < 0.01)。
| Group | Dose/mg·kg-1 | IL-1β | IL-6 | TNF-ɑ | CRP | IFN-γ | IL-18 |
| Control | - | 70.22±44.11 | 65.36±38.19 | 59.90±33.627 | 71.97±42.93 | 65.36±38.19 | 72.40±37.29 |
| Model | - | 189.18±51.07** | 163.09±57.06** | 157.85±55.05** | 166.68±44.38** | 150.60±30.45** | 167.35±63.31** |
| Isochlorogenic acid A | 50 | 105.53±26.09## | 88.09±34.64## | 60.52±35.06## | 98.04±37.85## | 56.61±26.79## | 73.03±43.91## |
| 100 | 87.26±43.27## | 90.07±66.73## | 73.96±31.81## | 88.51±44.65## | 69.82±57.06## | 82.72±49.74## | |
| **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs model | |||||||
异绿原酸A是一种二咖啡酰奎宁酸类化合物，与绿原酸属同分异构体，在中药金银花、忍冬藤、黑骨藤、菊花等天然植物含量较高。现已证实，异绿原酸A具有保肝抗炎、抗HBV、抑制大肠杆菌增殖等作用[5]。通过在大鼠体内经胶原诱导方式，构建和模拟RA模型分析后发现，胶原刺激后，模型组大鼠足跖部炎症引发的肿胀度明显增加，给予不同剂量的异绿原酸A后，模型大鼠足跖部炎症肿胀程度被明显抑制，表明异绿原酸A具有良好的抑炎药理活性。对模型大鼠免疫器官脾脏进行称重后发现，模型大鼠的脾脏经胶原诱导刺激后有明显肿胀和脏器系数增加表现，给予异绿原酸A后可以改善这种表现，提示异绿原酸A可能对脾脏内免疫细胞的炎性增殖有抑制作用，这种可能需从脾脏内淋巴细胞增殖活性进行下一步的相关探讨。
RA作为自身免疫疾病，炎性反应的过度激活目前被认为是导致RA滑膜增生和骨质破坏的重要诱因。NLRP3炎性复合体与人类多种自身免疫病相关，在中性粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞中都有表达，它由NOD样受体家族、凋亡相关斑点样蛋白和caspase-1组成[6-7]。当NLRP3炎性复合体活化后，可剪切前体caspase-1蛋白变为caspase-1，后者进一步刺激IL-1β、IL-18等白介素家族细胞因子活化，而白介素家族蛋白现被证实在RA病程中有重要作用[8-9]。CIA模型大鼠关节滑膜检测发现，异绿原酸A能明显抑制NLRP3炎性复合体在关节滑膜内的表达，进而抑制血浆内白介素家族IL-1β、IL-18的过表达。NF-κB蛋白是目前研究炎症的热门靶点之一，在胞质中与NF-κB抑制蛋白结合，形成无活性聚合体。当炎症信号产生时，胞质中NF-κB抑制蛋白被磷酸化，进一步被降解并释放NF-κB蛋白进入胞核，增强靶基因的转录，增强炎性反应[10-11]。检测CIA模型大鼠关节滑膜内NF-κB蛋白表达发现，异绿原酸A能明显抑制关节滑膜内NF-κB蛋白表达及其磷酸化水平，并抑制NF-κB抑制蛋白ɑ亚基的磷酸化水平，进而抑制了相应炎性反应。
人破骨细胞与成骨细胞可调节骨骼生长发育，并使骨组织更新处于平衡状态，维持正常的骨代谢。如果平衡被打破，破骨细胞多于成骨细胞，体内骨量降低，将难以维持骨骼的强度和弹性。TNF家族与NF-κB蛋白关系密切，RANKL属于TNF家族成员，其主要作为破骨细胞表面上RANK受体，与相应配体结合，促进破骨细胞成熟和分化。TNF-α、甲状旁腺激素等可促进RANKL过表达[12-14]。在RA患者体内，由增殖活化的T细胞和成纤维细胞等释放IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CRP等一系列因子，导致RANKL大量释放，激活并促进破骨细胞分化与成熟，导致体内破骨细胞大量生长，成骨细胞减少，引发体内骨量丢失，继而诱发关节骨组织缺损。CIA模型大鼠经异绿原酸A干预后，血浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18均表达下调，炎症级联反应被明显抑制，关节滑膜内的RANKL蛋白的过表达被明显抑制，骨关节病理显示，骨关节破坏征象明显减轻，表明异绿原酸A可能抑制滑膜内RANKL蛋白和其他炎症因子的表达，减轻CIA模型骨关节的损害程度。
综上，本研究明确了异绿原酸A可抑制大鼠关节滑膜内NLRP3、caspase-1、NF-κB p65、RANKL蛋白过表达、降低p-IκB-ɑ和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，抑制血浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18水平，进而减轻CIA大鼠的炎症反应。
| [1] |
张玲玲, 魏伟. 治疗自身免疫病药物研究进展[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(2): 149-56. Zhang L L, Wei W. Advance in drug treatment of autoimmune diseases[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(2): 149-56. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2019.02.001 |
| [2] |
侯彩平, 韩利文, 张凤, 等. 异绿原酸A的抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技, 2017, 38(12): 72-6. Hou C P, Han L W, Zhang F, et al. Study on the antioxidant activity of isochlorogenic acid A[J]. Sci Technol Food Industry, 2017, 38(12): 72-6. |
| [3] |
吴菁, 范凯健, 王婷玉. 二氢杨梅素对类风湿性关节炎大鼠脾脏免疫功能的调节作用[J]. 上海交通大学学报(医学版), 2018, 38(12): 1401-7. Wu J, Fan K J, Wang T Y. Regulation of dihydromyricetin on immune function of spleen in the rats with rheumatoid arthritis[J]. J Shanghai Jiaotong Univ (Med Sci), 2018, 38(12): 1401-7. doi:10.3969/j.issn.1674-8115.2018.12.001 |
| [4] |
宁丽常, 蹇孝丽, 岳萍, 等. 蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠胶原诱导性关节炎的干预机制[J]. 中国免疫学杂志, 2017, 33(9): 1361-5. Ning C L, Jian X L, Yue P, et al. Intervention effect of proteasome inhibitor MG132 in rats with collagen-induced arthritis[J]. Chin J Immunol, 2017, 33(9): 1361-5. doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.018 |
| [5] |
Wang J, Wang H, Peng Y, et al. Isochlorogenic acid A affects P450 and UGT enzymes in vitro and in vivo[J]. Chin J Nat Med, 2016, 14(11): 865-70. |
| [6] |
Afonina I S, Zhong Z, Karin M, et al. Limiting inflammation-the negative regulation of NF-κB and the NLRP3 inflammasome[J]. Nat Immunol, 2017, 18(8): 861-9. doi:10.1038/ni.3772 |
| [7] |
Tall A R, Westerterp M. Inflammasomes, neutrophil extracellular traps, and cholesterol[J]. J Lipid Res, 2019, 60(4): 721-7. doi:10.1194/jlr.S091280 |
| [8] |
Scirocco A, Pallotta L, Rengo M, et al. Myogenic oxidative imbalance interferes with antral motility in obese subjects[J]. Dig Liver Dis, 2018, 50(8): 820-7. doi:10.1016/j.dld.2018.03.005 |
| [9] |
Hong S, Yu J W. Prolonged exposure of lipopolysaccharide induces NLRP3-independent maturation and secretion of interleukin (IL)-1β in macrophages[J]. J Microbiol Biotechnol, 2018, 28(1): 115-21. doi:10.4014/jmb.1709.09017 |
| [10] |
Alkhalf M I, Khalifa F K. Blueberry extract attenuates γ-radiation-induced hepatocyte damage by modulating oxidative stress and suppressing NF-κB in male rats[J]. Saudi J Biol Sci, 2018, 25(7): 1272-7. doi:10.1016/j.sjbs.2018.07.002 |
| [11] |
Mitchell J P, Carmody R J. NF-κB and the transcriptional control of inflammation[J]. Int Rev Cell Mol Biol, 2018, 335: 41-84. doi:10.1016/bs.ircmb.2017.07.007 |
| [12] |
Tyrovola J B. The "mechanostat" principle and the osteoprotegerin-OPG/RANKL/RANK system PART Ⅱ. The role of the hypothalamic-pituitary axis[J]. J Cell Biochem, 2017, 118(5): 962-6. doi:10.1002/jcb.25793 |
| [13] |
Mansour A, Aboeerad M, Qorbani M, et al. Association between low bone mass and the serum RANKL and OPG in patients with nephrolithiasis[J]. BMC Nephrol, 2018, 19(1): 172. doi:10.1186/s12882-018-0960-z |
| [14] |
Araújo A A, Lopes de Souza G, Souza T O, et al. Olmesartan decreases IL-1β and TNF-α levels; downregulates MMP-2, MMP-9, COX-2, and RANKL; and upregulates OPG in experimental periodontitis[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2013, 386(10): 875-84. doi:10.1007/s00210-013-0886-8 |