2. 海南绿槟榔科技发展有限公司，海南 定安 571200
2. Hainan Green Areca Technology Development Co. LTD, Dingan Hainan 571200, China
阿尔兹海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种与年龄相关的，隐匿发展的神经系统退行性疾病，给家庭和社会带来沉重的负担[1]。AD的特征性病理变化为胞内神经纤维缠结，胞外β淀粉样(amyloid β protein，Aβ)沉积，神经元损伤及突触减少。Aβ为AD病理进程的关键因素，Aβ的神经毒性及其诱导的蛋白级联反应对AD的发生发展具有重要作用[2]。
研究表明，多酚类化合物具有很强的抗氧化能力，能够清除细胞内自由基，发挥神经保护作用[3-5]。此外，多酚类化合物中的某些成分还能够减少Aβ生成、促进Aβ消除，保护神经元免受Aβ神经毒性[6-8]。以往的文献中，对表没食子儿茶素没食子酸酯的研究较多，但对表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)研究较少。EGC作为一种多酚类化合物，广泛存在于茶叶、槟榔等植物中，其是否能够减轻Aβ对神经细胞的损伤，未见报道。因此，本实验选择SH-SY5Y细胞为研究对象，研究EGC对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药物与试剂EGC(HPLC>98%)，购自上海源叶生物科技有限公司；DMEM/F12培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、2′, 7′-二氯荧光黄双乙酸盐(2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，均购自Thermo Scientific公司；Aβ25-35、Hoechst 33258、MTT、氮乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，均购自Sigma公司；蛋白裂解液、β-actin抗体，均购自Cell Signaling Technology公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)细胞毒性检测试剂盒，购自碧云天生物技术公司；核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2，Nrf2)、血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化还原酶1(NADPH:quinone oxidoreductase 1，NQO1)、过氧化物还原酶6(peroxiredoxin 6，Prdx6)、硫氧还蛋白-1(thioredoxin-1，Trx1)、Lamin B1抗体，均购自Santa Cruz；丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。
1.1.2 仪器蛋白电泳仪、转膜仪、成像仪(Bio-Rad公司)；酶标仪(Molecular Devices)；高内涵分析仪(Thermo Scientific)。
1.2 细胞培养SH-SY5Y细胞购自中国医学科学院基础医学研究所，用含10% FBS的DMEM/F12培养液，37 ℃、5% CO2条件下培养。
1.3 Aβ25-35模型建立及分组细胞分为正常对照组、Aβ25-35损伤模型组、EGC低剂量组(Aβ25-35+5 μmol·L-1 EGC)、EGC中剂量组(Aβ25-35+10 μmol·L-1 EGC)、EGC高剂量组(Aβ25-35+20 μmol·L-1 EGC)和阳性对照组(Aβ25-35+5 mmol·L-1 NAC)。
1.4 MTT法检测细胞存活率实验终点，吸除原有培养液，每孔加入100 μL 0.5 g·L-1 MTT溶液，培养4 h后吸除MTT，加入100 μL DMSO振荡5 min，490 nm测定吸光度，计算细胞存活率。
1.5 LDH释放率考察细胞活力实验终点，取细胞上清，采用试剂盒检测LDH，具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.6 细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的检测实验终点，倾去细胞培养液，PBS洗涤1次，每孔加入50 μL终浓度为10 μmol·L-1 DCFH-DA和10 μg·mL-1 Hoechst 33258的DMEM/F12培养基。30 min后PBS洗涤3次，之后用高内涵细胞分析系统检测ROS水平。
1.7 氧化应激标志物检测实验终点，取细胞上清，采用试剂盒检测SOD、MDA和GSH-Px，具体操作按照试剂盒说明书进行。
1.8 Western blot法检测蛋白表达变化实验终点，用胞核胞质蛋白抽提试剂盒，分别提取核蛋白和细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜后，置于5% BSA室温封闭2 h。然后用稀释的Nrf2、NQO-1、HO-1、Prdx6、Trx1抗体，于4 ℃孵育过夜。之后，TBST洗涤3次，再加入稀释后二抗室温孵育2 h，TBST洗涤3次后显色成像。
1.9 免疫荧光法检测Nrf2的核转位实验终点，吸除原培养液，PBS洗涤1次后，每孔加入50 μL多聚甲醛溶液固定15 min；PBS洗涤1次，每孔加入50 μL 0.3% Triton-100孵育10 min；PBS洗涤1次，每孔加入50 μL 5% BSA室温封闭2 h；之后每孔加入50 μL Nrf2抗体稀释液孵育过夜；回收一抗后，用PBS洗涤3次，然后加入荧光二抗稀释液，37 ℃孵育1.5 h；PBS洗涤3次后，加入Hoechst 33258避光孵育30 min；最后PBS洗涤1次，置于高内涵分析仪进行检测。
1.10 统计学分析结果以x±s表示，对于统计学差异分析，使用GraphPad Prism version 7.0(GraphPad Software, CA, USA)软件中One-way ANOVA(Tukey′s post hoc test)方法进行统计处理。
2 结果 2.1 EGC对Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞活力的影响如Fig 1A所示，与正常对照组相比，3 μmol·L-1 Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞24 h后，细胞活力明显降低(P < 0.01)。EGC(10、20 μmol·L-1)和抗氧化阳性药NAC(5 mmol·L-1)能够逆转Aβ25-35对SH-SY5Y细胞造成的损伤，明显提高细胞存活率(P < 0.05，P < 0.01)。如Fig 1B所示，Aβ25-35明显提高SH-SY5Y细胞LDH的释放(P < 0.01)，EGC(5、10、20 μmol·L-1)和NAC(5 mmol·L-1)能够明显降低Aβ25-35诱导的LDH释放(P < 0.05，P < 0.01)。
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| Fig 1 Effects of EGC on Aβ25-35-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells (x±s, n=4) A:EGC increased the cell viability of Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells as determined by MTT assay; B: EGC decreased LDH release as determined by LDH assay.##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Aβ25-35 treated group. |
如Fig 2所示，3 μmol·L-1 Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞后，细胞中ROS释放量明显增加(P < 0.01)，10、20 μmol·L-1 EGC均能明显抑制Aβ25-35损伤导致的ROS释放(P < 0.01)。
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| Fig 2 Effects of EGC on Aβ25-35-induced ROS accumulation in SH-SY5Y cells (x±s, n=4) A:Green fluorescence represented the amounts of ROS(scale bar=20 μm); B: Green fluorescence intensity was quantified by ImageJ software.##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs Aβ25-35 treated group. |
如Tab 1所示，与正常对照组相比，Aβ25-35损伤导致SH-SY5Y细胞中SOD和GSH-Px活性明显降低，MDA含量明显升高(P < 0.01)。EGC能够明显提高SOD和GSH-Px活性，减少MDA含量，抑制氧化应激损伤。
| Item | SOD | GSH-Px | MDA |
| Control | 100±8.101 | 100±12.75 | 100±6.44 |
| Aβ25-35 | 36.53±5.374## | 48.63±2.763## | 243.4±43.17## |
| Aβ25-35+5 μmol·L-1 EGC | 50.29±9.043 | 55.05±4.239 | 181.1±19.64 |
| Aβ25-35+10 μmol·L-1 EGC | 59.98±9.507** | 64.19±3.417* | 155.9±25.32* |
| Aβ25-35+20 μmol·L-1 EGC | 57.68±9.411* | 70.88±6.246** | 141.2±69.11* |
| Data were expressed as % of the control, ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Aβ25-35 treated group. | |||
采用Western blot和免疫荧光检测SH-SY5Y细胞内Nrf2核转位情况，结果如Fig 3所示，正常SH-SY5Y细胞核中Nrf2水平较低，Aβ25-35损伤后SH-SY5Y细胞核中Nrf2蛋白水平略有增加。EGC干预能够明显增强Aβ25-35损伤后Nrf2的核转位。
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| Fig 3 Effects of EGC on Nrf2 levels in Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells (x±s, n=4) A: Western blot analysis of Nrf2 in the nucleus. Lamin B1 was used as a loading control; B: Immunofluorescent staining for Nrf2 nuclear translocation(scale bar=20 μm); C:Quantitative analysis of Nrf2 in the nucleus.*P < 0.05, **P < 0.01 vs Aβ25-35 treated group. |
采用Western blot检测SH-SY5Y细胞内Nrf2下游抗氧化蛋白的表达情况，如Fig 4所示，EGC干预后能够明显增强Aβ25-35损伤后Nrf2诱导的Ⅱ相辅酶HO-1、NQO1、Prdx6和Trx1的表达，提高细胞的抗氧化能力。
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| Fig 4 Effects of EGC on HO-1, NQO1, Prdx6, Trx1 levelsin Aβ25-35-treated SH-SY5Y cells (x±s, n=4) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Aβ25-35 treated group. |
本实验采用Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞模型，探讨EGC对Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞氧化应激的影响。3 μmol·L-1 Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞24 h后，细胞存活率明显降低，LDH释放明显增加。EGC能够减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤，提高细胞存活率，降低LDH释放。
氧化应激损伤是指机体抗氧化水平低于氧化水平，氧化中间产物在体内聚积，打破抗氧化与氧化平衡，造成机体损伤，诱发多种疾病[9-10]。研究表明，氧化应激在AD病理生理过程中发挥着重要作用[11-12]。Nrf2是细胞发生氧化应激反应的关键调节因子，对维持细胞内氧化还原水平至关重要[14-15]。本文实验结果表明，Aβ25-35损伤能够明显增加SH-SY5Y细胞ROS水平，而EGC可以明显降低Aβ25-35诱增的细胞内ROS。正常生理状态下，Nrf2-Keap1处于抑制状态，Aβ25-35损伤后SH-SY5Y细胞ROS水平明显增加，Nrf2-Keap1被激活发生解离，解离后的Nrf2蛋白在细胞核中聚集，促进SOD、GSH-Px及HO-1等下游产物增多[16-17]。
SOD在新陈代谢中起重要作用，能够特异性清除氧自由基，使细胞免受氧化应激损伤。GSH-Px也可以减少过氧化物在细胞内堆积，维持细胞正常生理功能。对抗氧化酶水平，Aβ25-35损伤后明显降低SH-SY5Y细胞中SOD和GST-Px的活性，而EGC可以明显升高SOD和GSH-Px活性。MDA是脂质过氧化终产物，可影响线粒体呼吸链中关键酶的活性，常用于评估氧化应激反应程度和自由基水平[13]。本实验结果表明，与对照组相比，Aβ25-35损伤导致脂质过氧化产物MDA积累，而EGC可以明显降低Aβ25-35诱增的MDA含量。采用Western blot和免疫荧光检测了SH-SY5Y细胞核中Nrf2蛋白表达。正常SH-SY5Y细胞核中Nrf2呈弱阳性表达，Aβ25-35损伤使细胞核中Nrf2蛋白水平略有增加，但与正常对照组相比差异不明显。EGC干预能够明显增强Aβ25-35损伤后Nrf2核转位。检测Nrf2-Keap1通路下游Ⅱ相辅酶的表达水平表明，EGC处理能够明显增强Aβ25-35损伤后Nrf2诱导的Ⅱ相辅酶HO-1、NQO1、Prdx6和Trx1的表达。SOD、GSH-Px、HO-1、NQO1、Prdx6和Trx1协同清除ROS，保护细胞免受氧化应激损伤。
综上所述，表没食子儿茶素能够激活Nrf2-Keap1通路，调节氧化应激反应中相关酶的活性，阻断Aβ25-35导致的ROS产生，提高SOD和GSH-Px活性，减少MDA含量，提高机体抗氧化水平，改善氧化损伤，降低Aβ25-35的神经毒性。
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