随着经济、社会不断发展和人们物质生活水平的不断提升,高脂肪、高热量、低膳食纤维的饮食结构成为人们主要的饮食结构。大量研究显示,长期高脂饮食诱导的肥胖与代谢综合征、心血管疾病和不育症等诸多疾病的发生、发展密切相关[1-2],肥胖问题已成为一个全球性的健康问题。临床研究发现,与正常体质量男性相比,肥胖男性精液质量下降,主要表现在精子浓度、活力下降,精子数量减少,精子DNA损伤增加[3]。而在高脂诱导的肥胖小鼠模型中,性激素水平下降,睾丸组织内炎症因子TNF-α、IL-6 mRNA水平明显升高,生精小管结构破坏,血睾屏障受损,小鼠生育能力下降[4]。因此,抑制睾丸炎症反应,减轻生精细胞凋亡,是改善肥胖所致男性生殖功能障碍的重要措施之一。
竹节参为我国传统补虚中药,系五加科人参属植物竹节参的干燥根茎,竹节参总皂苷(saponins of Panax Japonicus,SPJ)为其主要的活性成分。现代药理学研究表明,SPJ具有良好的抗炎活性。研究显示,SPJ可明显降低脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β mRNA表达水平,并且抑制NF-κB p65蛋白表达水平[5];可通过降低炎症因子TNF-α、IL-1β mRNA的表达水平,减轻棕榈酸诱导的HepG2细胞的凋亡[6]。此外,SPJ还可改善衰老所致大鼠睾丸生殖功能障碍,其机制与抑制生殖细胞的DNA损伤和凋亡有关[7]。而SPJ是否可改善高脂饮食诱导小鼠生殖功能障碍,其机制是否与抑制小鼠睾丸炎症相关,尚未有相关研究报道。故本实验从调节睾丸炎症的角度,探讨SPJ改善高脂饮食诱导肥胖导致生殖功能障碍的可能作用机制。
1 材料 1.1 实验动物SPF级♂BALB/c小鼠40只,体质量(16~18) g,4~6周龄,动物生产许可证号:(SCXK)(鄂)2017-0012,购置并饲养于三峡大学实验动物中心,分笼饲养,饲料按每日每只4 g给予,自由饮水。高脂饲料(编号:H10060),购于北京华阜康生物科技股份有限公司,饲料配比如下:按照蛋白质20%、碳水化合物20%、脂肪60%压制而成,并进行辐照灭菌处理。
1.2 药物与试剂于湖北恩施竹节参种植基地购买竹节参药材,经湖北省天然产物研究与利用重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物竹节参。SPJ的制备据课题组对竹节参的前期研究,取干燥竹节参药材粉末,利用醇提取法进行分离和纯化,提取率为18.4%,纯度为83.48%。兔单抗β-actin(货号:4970L)、兔多抗p-NF-κB(货号:#3031),均购自美国Cell Signaling Technology公司;鼠单抗TNF-α(货号:sc-52746),美国Santa Cruz公司;兔多抗IL-1β(货号:ab9722)、鼠单抗F4/80(货号:ab6640),美国Abcam公司;山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗,武汉科瑞生物有限公司;Alexa Fluor594驴抗小鼠IgG(H+L)(货号:127802),美国Jackson Immuno Research公司;ECL显影液,武汉谷歌生物科技公司;TUNEL试剂盒(货号:10768100),德国Roche公司。
1.3 仪器Power Pas Basic200 Western blot电泳仪(美国Bio-Rad公司);A1R+激光共聚焦显微镜(日本Nikon公司);IX53倒置光学显微镜(日本Olympus公司);TP 102自动脱水机、EG 1150C超薄切片机、EG 1150H石蜡包埋机(德国Leica公司)。
2 方法 2.1 动物分组及处理40只♂BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,即正常对照组(Control)、高脂模型组(Model)、SPJ低、高剂量组(15、45 mg·kg-1)。正常对照组给予普通饲料喂养,其他3组给予高脂饲料喂养;SPJ各剂量组小鼠灌胃给予相应剂量的药物,而正常对照组和高脂模型组给予等量生理盐水灌胃,每日1次,持续给药4个月。
睾丸和附睾指数测定:小鼠睾丸和附睾组织于低温环境中取材,滤纸吸干残余液体,电子天平称重并记录。先计算双侧睾丸和附睾平均质量,后计算睾丸和附睾指数。计算公式如下所示:睾丸指数(mg·g-1)=睾丸质量(mg)/小鼠体质量(g);附睾指数(mg·g-1)=附睾质量(mg)/小鼠体质量(g)。
2.2 HE染色检测小鼠睾丸组织形态给药4个月后眼球取血,颈椎脱臼处死小鼠,取单侧睾丸,扎破两端白膜置于4%多聚甲醛中,4 ℃固定24 h。睾丸组织经TP 1020自动脱水机脱水,脱水完成后进行石蜡包埋,EG 1150C超薄切片机上进行超薄石蜡切片。将组织切片置于60 ℃烘箱内烤片3~5 h,经透明、脱蜡、HE染色、封片等处理后,各组小鼠睾丸组织形态于光镜下观察,并在同等条件下取图。
2.3 TUNEL检测小鼠生精细胞凋亡将睾丸组织石蜡切片于二甲苯内透明后,置于不同浓度的乙醇中脱蜡后,按照TUNEL试剂盒说明书步骤进行操作。切片经中性树胶封片后,在倒置光学显微镜下观察各组小鼠睾丸组织生精细胞,凋亡生精细胞的细胞核被染为棕黄色。
2.4 小鼠精子存活率及精子数量的分析精子存活率:将小鼠双侧附睾于生理盐水中剪碎,置于37 ℃温育3 min,待精子从附睾中游离出来。采用伊红Y染色法检测精子存活率,用生理盐水将伊红Y配制成浓度为5 g·L-1的溶液。取20 μL新鲜精液与10 μL伊红Y溶液混匀后,取10 μL溶液滴加于载玻片上并覆以盖玻片,待溶液均匀分布于载玻片后,直接置于×400光镜下观察,死精子被染液染色,活精子透亮不被着色,计数视野内存活的精子个数。每只小鼠取15个随机视野,共计200个精子,计算精子存活率,公式如下:精子存活率=活精子总数/精子总数×100%。
精子数量:将小鼠精子原液经生理盐水10倍稀释后,取1滴精子悬液滴于血球计数板上,盖上盖玻片,×40光学显微镜下进行精子计数,计算4个象限内精子数量,取平均值,即为稀释后小鼠精液中精子数量。
2.5 Western blot检测小鼠睾丸组织内p-NF-κB及下游炎症因子蛋白表达水平Western blot检测小鼠睾丸组织中p-NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表达水平,称取20~30 mg的睾丸组织,按RIPA裂解液: PMSF=100 : 1的比例提取总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒检测所提蛋白的浓度,取100 μL蛋白提取液,加入25 μL蛋白上样缓冲液混匀,置于沸水浴中加热变性10 min后,进行电泳和转膜,5%脱脂牛奶封闭1 h,然后一抗4 ℃孵育过夜,二抗常温孵育1 h,超敏ECL显影液进行显影,Image Pro Plus软件进行分析,以β-actin为内参,计算各蛋白条带与内参照的灰度比值,每组实验各重复3次。
2.6 免疫荧光法检测睾丸组织内巨噬细胞数量取睾丸组织石蜡切片,常规脱蜡,高压修复10 min,冷却5 h;5% BSA封闭组织,室温孵育60 min;F4/80由0.3% Triton X-100稀释后,4 ℃孵育过夜;复温30 min后,避光孵育荧光二抗60 min;细胞核经DAPI染色10 min后,经抗荧光淬灭剂封片后,样本的定位和表达于共聚焦显微镜下观察,随机取×200镜下5个视野,计算每个视野下巨噬细胞数量,取均值。
2.7 统计学方法数据均以x±s表示,通过GraphPad Prism 7.0进行数据统计分析并绘制统计图,组间差异显著性通过单因素方差分析检验。
3 结果 3.1 SPJ对高脂饮食小鼠体质量、睾丸和附睾质量及其指数的影响如Tab 1所示,高脂模型组小鼠体质量与正常对照组比较明显升高,而SPJ可明显降低小鼠体质量;高脂模型组小鼠睾丸和附睾质量及其指数较正常对照组明显降低,而SPJ可明显升高小鼠睾丸和附睾质量及其指数。
Group | Body mass/g | Testis weight/g | Epididymis weight/g | Testis index/mg·g-1 | Epididymis index/mg·g-1 |
Control | 32.21±2.39 | 0.23±0.012 | 0.082±0.004 | 6.74±0.54 | 2.46±0.14 |
Model | 40.48±3.30## | 0.20±0.014## | 0.074±0.004## | 5.33±0.52## | 1.97±0.15## |
SPJ 15 mg·kg-1 | 36.17±3.44* | 0.21±0.007 | 0.076±0.003 | 5.66±0.40 | 2.15±0.18 |
SPJ 45 mg·kg-1 | 34.55±2.71** | 0.22±0.009** | 0.081±0.004* | 6.14±0.45** | 2.41±0.19** |
##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
Tab 2结果显示,与正常对照组相比,高脂模型组小鼠精子存活率和精子数量明显减少;而SPJ干预后可提高小鼠精子存活率及精子数量。
Group | Sperm viability/% | Sperm count/109·L-1 |
Control | 82.13±1.56 | 8.71±0.78 |
Model | 62.88±4.39## | 5.24±0.81## |
SPJ 15 mg·kg-1 | 74.06±3.95** | 7.66±0.31* |
SPJ 45 mg·kg-1 | 72.78±1.83** | 8.16±0.53** |
##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
Fig 1的HE结果显示,正常对照组小鼠睾丸生精小管之间连接紧密,各级生精细胞排列整齐、连接紧密;而高脂模型组小鼠睾丸各生精小管间连接疏松,生精小管内各级生精细胞间连接疏松、排列紊乱,生精细胞层数减少,部分生精细胞脱落;与高脂模型组相比,SPJ可明显改善睾丸生精小管的结构,使各级生精细胞间层数和数目增加、连接紧密、排列整齐。
3.4 SPJ对高脂饮食小鼠睾丸组织中生精细胞凋亡的影响如Fig 2所示,与正常对照组相比,高脂模型组中各级生精细胞凋亡数量明显增加;而SPJ可明显改善各级生精细胞的凋亡。
3.5 SPJ对高脂饮食小鼠睾丸组织中p-NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表达的影响如Fig 3所示,与正常对照组小鼠睾丸组织相比,高脂模型组中p-NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表达水平明显升高;与高脂模型组相比,SPJ低、高剂量组p-NF-κB、TNF-α和IL-1β蛋白表达水平明显下调。
3.6 SPJ对高脂饮食小鼠睾丸组织中巨噬细胞数量的影响F4/80是小鼠巨噬细胞特异性的标记物,本实验采用免疫荧光法检测高脂饮食对小鼠睾丸组织内睾丸巨噬细胞数量的影响及SPJ的干预作用。如Fig 4所示,与正常对照组相比,高脂模型组睾丸组织中巨噬细胞数量增加,而SPJ可明显下调睾丸巨噬细胞数量。
4 讨论随着物质生活水平的不断提高,高脂饮食成为人们的主要饮食谱,长期高脂饮食可能导致肥胖。临床研究发现,肥胖男性的精液浓度及精子数量均低于正常男性[3];而男性少精子症和无精子症的患病率增加与男性肥胖密切相关[8]。在高脂饮食诱导肥胖小鼠模型中,小鼠睾丸生精小管内生精细胞连接疏松、凋亡增加[4];氟化钠诱导的大鼠睾丸炎症模型中,生精细胞凋亡增加[9]。芹菜素可通过减轻丙烯腈诱导的大鼠睾丸炎症,来减轻生殖细胞凋亡[10]。本研究发现,SPJ可通过改善高脂饮食小鼠精液质量,减轻生精细胞的凋亡,进而改善高脂饮食小鼠睾丸生殖功能障碍。
大量研究表明,高脂饮食可诱导机体的慢性炎症反应,而炎症与男性生殖功能障碍密切相关[11-12]。NF-κB为炎症反应重要的转录因子,通过转录激活下游TNF-α、IL-1β等炎症因子,参与机体炎症反应。研究发现,淫羊藿总黄酮通过下调NF-κB、TNF-α和IL-1β的蛋白表达,减轻衰老大鼠海马组织中的炎症[13]。在氟化钠诱导的大鼠睾丸炎症模型中,睾丸组织内TNF-α、IL-1β和p-NF-κB的蛋白表达水平明显升高[9]。在自身免疫性睾丸炎的小鼠模型中,TNF-α mRNA的表达水平明显上升,睾丸质量减轻,生精细胞排列紊乱[14]。本研究发现,高脂饮食所致睾丸生殖功能障碍与睾丸炎症有关,而SPJ明显下调p-NF-κB、TNF-α和IL-1β的蛋白表达水平。以上结果表明,SPJ可通过抑制NF-κB通路介导的睾丸炎症,从而改善高脂饮食小鼠睾丸生殖功能障碍。
睾丸巨噬细胞位于睾丸间质内,在睾丸炎症的发生中起着主要作用。在肥胖诱导的小鼠睾丸炎症模型中,睾丸巨噬细胞的数量明显增加[15]。本研究发现,SPJ可明显下调小鼠睾丸巨噬细胞的数量,提示SPJ可通过减轻睾丸巨噬细胞的浸润,抑制睾丸炎症,进而改善高脂饮食小鼠生殖功能障碍。
综上所述,SPJ对高脂饮食诱导的小鼠生殖功能障碍有明显的改善作用,其机制可能与减轻巨噬细胞的浸润,抑制NF-κB通路介导的睾丸炎症有关。这为研究肥胖男性生殖功能障碍提供了新的思路,可能为临床治疗男性生殖功障碍提供新的治疗药物。
( 致谢: 本实验主要在三峡大学医学院中药药理国家中医药管理局科研三级实验室和三峡大学感染与炎症损伤研究所完成。在此感谢课题组全体老师及同学的指导和帮助。)
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