2. 福建医科大学附属协和医院血液科, 福建 福州 350001;
3. 南方医科大学南方医院血液科，广东 广州 511436;
4. 厦门医学院科学实验中心, 福建 厦门 361023
2. Dept of Hematology, Union Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, China;
3. Dept of Hematology, Southern Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 511436, China;
4. Centre of Science Lab, Xiamen Medical College, Xiamen Fujian 361023, China
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是具有明显遗传异质性的临床侵袭性疾病。靶向异常基因治疗是当前研究热点。黏附调节分子1(adhesion regulating molecule 1，ADRM1)亦被称为hRpnl3(human Rpn13)，是26S蛋白酶体亚单位19S调节颗粒上两个主要泛素受体之一，决定26S蛋白酶体结构不对称性。该蛋白在多细胞真核生物内高度保守，在生命过程中可能发挥重要功能。有研究表明[1-3]，ADRM1在肝癌、胃癌、急性白血病等多种恶性肿瘤中过表达，下调ADRM1蛋白水平可明显抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡。因此，ADRM1可能成为肿瘤治疗靶点。
双亚苄基哌啶RA190是近几年研究发现的ADRM1抑制剂，通过与ADRM1的半胱氨酸88共价结合，抑制蛋白酶功能[4]。本实验拟通过检测不同浓度RA190作用下HL60细胞活率，分析细胞周期与凋亡及ADRM1蛋白水平，以了解RA190在AML中作用机制，为AML治疗采用靶向ADRM1策略提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料人急性粒细胞白血病部分分化型细胞HL60为本实验室保存。RA190(MCE); PI(KeyGEN Biotech); Annexin V FLUOS Staining Kit(Roche); Western blot抗体(CST公司); RPMI 1640培养基(Corning); 胎牛血清(Gemini)。流式细胞仪EPICSXL(BECKMAN COULTER)。
1.2 方法 1.2.1 细胞毒性实验设不同浓度RA190(终浓度0.5、1、2、4 μmol·L-1)实验组和空白对照组，采用台盼蓝拒染法于细胞自动计数板上计数。
1.2.2 流式细胞术检测细胞周期与凋亡设不同浓度RA190实验组(0.5、1 μmol·L-1)和空白对照组，按照PI及Annexin V FLUOS Staining Kit试剂盒说明书操作。
1.2.3 Western blot检测细胞内蛋白表达收集各组细胞，PBS洗2次，加入RIPA细胞裂解液(含1 mmol·L-1 PMSF、1 mmol·L-1正钒酸钠、10 mg·L-1抑肽酶)提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取40 μg总蛋白进行Western blot实验。10% SDS-PAGE电泳后，转膜，分别用β-actin、ADRM1、Cyclin B1一抗与膜上的抗原结合，然后用HRP偶联的二抗与其反应，用ECL化学发光试剂检测，经压片曝光后，显影和定影。比较各组蛋白表达情况。
1.2.4 统计学分析所有实验2个复孔，独立重复3次; 正态分布的计量资料的描述采用x±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结果 2.1 RA190对HL60细胞增殖的影响随RA190浓度提高，HL60细胞活率降低(Tab 1)，说明RA190抑制HL60细胞增殖，半抑制浓度(IC50)约为3.1 μmol·L-1。
| RA190/μmol·L-1 | Viability/% |
| 0 | 94.84 |
| 0.1 | 91.09 |
| 0.5 | 83.02 |
| 1 | 77.69 |
| 2 | 62.10 |
| 4 | 43.24 |
RA190作用下，HL60细胞G0/G1期比率比空白对照组明显增加(P＜0.05)，见Tab 2。
| RA190/μmol·L-1 | Cell cycle/% | Apoptosis/% | ||||
| G0/G1 | S | G2/M | Early | Late | ||
| 0 | 40.15±1.33 | 19.56±1.30 | 31.78±0.74 | 1.18±0.08 | 0.64±0.25 | |
| 0.5 | 55.95±0.43* | 13.05±0.59* | 22.50±0.26* | 17.45±0.44* | 5.89±1.04* | |
| 1 | 49.71±1.56* | 12.31±1.60* | 26.10±1.67* | 40.48±7.35* | 29.36±0.57* | |
| *P＜0.05 vs RA190 0 μmol·L-1 | ||||||
Tab 2结果显示，随着RA190浓度提高，HL60细胞早期与晚期凋亡均增加(P＜0.05)。
2.4 RA190对ADRM1蛋白水平影响由于RA190诱导HL60细胞G0/G1期阻滞，本实验检测了Cyclin B1蛋白水平。结果显示，实验组细胞ADRM1与Cyclin B1蛋白表达均减少。
3 讨论研究表明[4-5]，双亚苄基哌啶RA190与泛素受体ADRM1结合后，快速触发多泛素蛋白累积，诱导对硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤细胞凋亡，也抑制卵巢癌、肝癌等多种肿瘤细胞增殖。本实验中，随RA190浓度提高，HL60细胞活率下降、凋亡增加、G1期停滞，说明RA190对HL60细胞具有明显毒性; 此时细胞内ADRM1和Cyclin B1蛋白减少。这与预期及其他学者研究结果一致。
ADRM1募集UCH37形成ADRM1/UCH37复合物，介导NF-κB降解与活性，参与细胞周期和凋亡过程。UCH37通过影响Bax/Bcl-2比率和caspase-9、caspase-3酶活性，抑制细胞凋亡; NF-κB转录因子对绝大多数恶性肿瘤具有促癌作用。因此，ADRM1可能通过UCH37抑制HL60细胞凋亡，也可能通过NF-κB信号通路起作用。
肿瘤细胞增殖加速常伴随细胞周期改变，而细胞周期受周期调控蛋白影响。哺乳动物细胞中，Cyclin B从G1期晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期达到最大值，并一直维持到M期中期后迅速降解。RA190作用下，细胞内Cyclin B1蛋白表达减少，阻滞细胞从G1期进入S期，其机制是RA190的直接作用，还是ADRM1表达减少导致？有待后续研究。
| [1] |
Jiang R T, Yemelyanova A, Xing D, et al. Early and consistent overexpression of ADRM1 in ovarian high-grade serous carcinoma[J]. J Ovarian Res, 2017, 10(1): 53. doi:10.1186/s13048-017-0347-y |
| [2] |
Zheng X, Guo Y, Chen Y, et al. Knockdown of adhesion-regulating molecule 1 inhibits proliferation in HL60 cells[J]. Acta Haematol, 2015, 134(2): 88-100. doi:10.1159/000369916 |
| [3] |
郑晓辉, 黄家福, 徐淑娟, 等. 蛋白酶体抑制剂MG132对急性髓系白血病细胞增殖与凋亡的影响[J]. 中国药理学通报, 2019, 35(3): 327-34. Zheng X H, Huang J F, Xu S J, et al. Effect of MG132 on acute myeloid leukemia cell proliferation and apoptosis[J]. Chin Pharmacol Bull, 2019, 35(3): 327-34. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2019.03.008 |
| [4] |
Anchoori R K, Karanam B, Peng S, et al. A bis-benzylidine piperidone targeting proteasome ubiquitin receptor RPN13/ADRM1 as a therapy for cancer[J]. Cancer Cell, 2013, 24(6): 791-805. doi:10.1016/j.ccr.2013.11.001 |
| [5] |
Lu X, Zhou C, Li R, et al. Long noncoding RNA AFAP1-AS1 promoted tumor growth and invasion in cholangiocarcinoma[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 42(1): 222-30. doi:10.1159/000477319 |