肠上皮细胞屏障功能丧失与很多疾病相关，并会导致全身免疫系统激活，促进慢性病毒感染进展及代谢性疾病。尽管肠道通透性在炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、I型糖尿病、乳糜泻等疾病中占据着非常重要的位置，但是在实际治疗或干预中并未得到足够的重视。恢复肠道通透性是治疗这类疾病的一种主要手段，目前应用的药物有抗TNF-α的单克隆抗体英孚利昔单抗(Infliximab)，它能在治疗糖皮质激素抵抗的克罗恩病(Crohn's disease，CD)时，恢复肠通透性和上皮屏障功能[1]。除此之外，用于治疗肠道疾病的在研药物还包括生长因子、益生菌、抑制NF-κB信号通路的药物[2]、肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)抑制剂[3]和蛋白酶激活受体-2(protease-activated receptor-2，PAR2)拮抗剂[4]等。
寻找合适的药物及治疗方法保护肠上皮细胞，增强肠上皮细胞紧密连接，对于改善上述疾病至关重要。肠道菌群在很多疾病的发生、发展过程中起到关键作用，衰老、高血压、糖尿病、慢性肝脏疾病及肠道疾病如IBD等，都与肠道菌群有关。硒是一种重要的微量元素，能以无机或有机的形式存在，硒掺入蛋白质中可形成硒代胱氨酸。饮食中增加硒能够通过减少氧化应激，来缓解热应激所导致的猪肠上皮屏障受损[5]。富硒益生菌综合了微量元素硒和益生菌的优势，改善♂小鼠繁殖能力[6]；改善小猪对高温环境的适应性、调节肠道菌群，改善免疫功能及抗氧化状态[7]；改善高脂饮食导致的小鼠脂代谢紊乱及肝损伤[8]。对于富硒长双歧杆菌影响肠上皮细胞的研究还较少，本研究拟通过研究富硒长双歧杆菌水溶性蛋白对肠上皮细胞的保护作用，探讨其保护肠上皮细胞的机制，以阐明富硒长双歧杆菌对肠道疾病潜在的保护作用。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器富硒长双歧杆菌(菌号：DD98)、水溶性蛋白样品(批号：20170609)，由江苏德禧生物科技有限公司提供；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、MTT、凋亡检测试剂盒，购自Sigma-Aldrich公司；JC-1，购自Thermo Fisher公司；qPCR试剂盒，购自Bio-Rad公司；其余试剂为市售分析纯。Sunrise Touchscreen Scanning酶联免疫检测仪(TECAN公司)；BD FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)；ABI 7300定量PCR仪(ThermoFisher公司)。
1.2 细胞株大鼠肠上皮细胞IEC6，购自中科院上海细胞所。用含10%新生牛血清的DMEM完全培养基，培养于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中。
1.3 方法 1.3.1 制备富硒长双歧杆菌水溶性蛋白取富硒双歧杆菌菌体(约0.5 g)，加入5 mL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，超声破碎(550 W，25 min)后，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min，取上清，加入100 U DNase和2.5 mg RNaseA，4 ℃静置1 h，以消化核酸。随后向上清中加入4倍体积冷丙酮，-20 ℃过夜沉淀蛋白。4 ℃、12 000×g离心5 min，弃上清，挥干丙酮，沉淀用蒸馏水重溶，得到富硒双歧杆菌水溶蛋白溶液。冻干，-20 ℃保存备用。富硒长双歧杆菌水溶性蛋白中含硒量为1.23 mg·g-1，按照60 kg体重成人每日补充100~200 μg硒，则大鼠肠上皮细胞培养液中受试的富硒长双歧杆菌水溶性蛋白浓度应为30~60 mg·L-1。实验中选择10、30、100 mg·L-1进行检测。低温离心机购自艾本德中国有限公司。
1.3.2 细胞活力检测将大鼠肠上皮细胞IEC6接种于96孔板中，用终浓度为50 mg·L-1 LPS处理IEC6细胞，同时加入不同浓度的富硒长双歧杆菌水溶性蛋白孵育20 h后，加入终浓度为0.4 g·L-1的MTT继续孵育4 h，96孔板1 000×g离心5 min，弃上清，每孔加入200 μL DMSO溶解沉淀，并于495 nm波长下测定吸光度。
1.3.3 细胞凋亡检测用50 mg·L-1 LPS处理IEC6细胞，同时加入不同浓度的富硒长双歧杆菌水溶性蛋白孵育24 h后，收集细胞，PBS洗涤两遍，参照试剂盒说明书进行。用400 μL结合缓冲液重悬IEC6细胞，使用Annexin V-FITC和PI染色后，用流式细胞仪检测。
1.3.4 细胞线粒体膜电位检测用50 mg·L-1 LPS和不同浓度的富硒长双歧杆菌水溶性蛋白处理IEC6细胞24 h，收集细胞，PBS洗涤两遍，加入终浓度为5 mg·L-1的JC-1染料，染色15 min，用流式细胞仪检测。
1.3.5 Real-time PCR检测50 mg·L-1 LPS和不同浓度的富硒长双歧杆菌水溶性蛋白与IEC6细胞共同孵育24 h，收集细胞，按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录成cDNA。扩增及定量使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix试剂盒，反应条件为：95 ℃ 5 min，40个下述循环95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，并作熔解曲线检测扩增基因的特异性。结果表示为与阴性对照的变化倍数(以GAPDH作为参照基因进行标准化)。引物序列如下：ZO-1正向：5'-TTGGGACAGAGCCTATGGAACGG-3′，反向：5′-GAGCGAACTGAATGGTCTGATGC-3′；Occludin正向：5′-ACTGACTGGGTTTGGGCTAC-3′，反向：5′-TCACCAAGGAAGCGATGAAGCAA-3′；GAPDH正向：5′-TATGACTCTACCCACGGCAAGT-3′，反向：5′-ATACTCAGCACCAGCATCACC-3′。PCR仪购自Bio-Rad。
1.3.6 统计学分析数据用x±s表示，使用Graphpad Prism 6.0软件进行单因素方差分析和Student′s t test差异分析。
2 结果 2.1 富硒长双歧杆菌水溶性蛋白抑制LPS引起的IEC6细胞活力下降用50 mg·L-1 LPS处理IEC6细胞，同时加入不同浓度的富硒长双歧杆菌水溶性蛋白，孵育24 h后，用MTT法检测细胞活力。Fig 1结果显示，LPS处理使细胞活力明显下降，而不同浓度的富硒长双歧杆菌水溶性蛋白能够明显缓解LPS抑制细胞活力的作用。其中低、中、高浓度组均有效，但组间差异无显著性。
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Fig 1 Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum increased IEC6 cell viability (x±s, n=5)
1:Control; 2:LPS; 3:LPS+Se 10 mg·L-1; 4:LPS+Se 30 mg·L-1; 5:LPS+Se 100 mg·L-1 Se: Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum. #P < 0.05 vs control; *P < 0.05 vs LPS. |
处理方法同上所述，Fig 2结果显示，LPS处理下，IEC6细胞Annexin-V阳性及PI阳性的细胞比例明显增加，而加入不同浓度的富硒长双歧杆菌水溶性蛋白，IEC6的细胞凋亡比例有所下降。
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| Fig 2 Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum protected LPS-induced IEC6 cell apoptosis (x±s, n=3) 1:Control; 2:LPS; 3:LPS+Se 10 mg·L-1; 4:LPS+Se 30 mg·L-1; 5:LPS+Se 100 mg·L-1. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05 vs LPS |
细胞线粒体膜电位倒塌时，JC-1单体增加，聚合体减少，表现为FL2通道荧光强度下降。通过检测JC-1聚合体荧光强度可以反映细胞线粒体膜电位水平。Fig 3结果显示，富硒长双歧杆菌水溶性蛋白能够抑制LPS引起的IEC6细胞JC-1聚合体荧光强度降低，表明富硒长双歧杆菌水溶性蛋白能够抑制线粒体膜电位倒塌，保护IEC细胞线粒体功能。
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| Fig 3 Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum protected LPS-induced IEC6 cell mitochondrial membrane potential collapse (x±s, n=3) 1:Control; 2:LPS; 3:LPS+Se 10 mg·L-1; 4:LPS+Se 30 mg·L-1; 5:LPS+Se 100 mg·L-1. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05 vs LPS |
肠上皮细胞间的紧密连接决定了肠道内电解质及水分的平衡，其主要蛋白包括ZO-1和Occludin。因此，我们以ZO-1、Occludin mRNA的改变来判断肠上皮细胞紧密连接的变化。如Fig 4所示，LPS刺激IEC6细胞后，导致ZO-1、Occludin mRNA水平降低，而富硒长双歧杆菌水溶蛋白能够抑制LPS的这种作用，升高ZO-1、Occludin的mRNA水平。
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| Fig 4 Water-soluble proteins from selenium-enriched Bifidobacterium longum protected decrease of LPS-induced IEC6 cell tight junction protein ZO-1 and Occludin mRNA levels (x±s, n=5) 1:Control; 2:LPS; 3:LPS+Se 10 mg·L-1; 4:LPS+Se 30 mg·L-1; 5:LPS+Se 100 mg·L-1. ##P < 0.01 vs control; *P < 0.05, **P < 0.01 vs LPS |
单层肠上皮细胞在机体和外部环境之间形成了一道物理和功能性的屏障，它们能调节营养物质的吸收、水及电解质的流动，并组成了抵御毒素和肠外病原体的第一道屏障。多种因素均可以导致该屏障的损害，造成肠上皮屏障功能紊乱，增加肠通透性，进而会诱发和加重炎性肠病。肠上皮细胞表面表达多种受体，可以与细胞因子结合，参与免疫级联反应，加重炎症反应，进而引发一系列疾患，如IBD、I型糖尿病、乳糜泻。完整状态的肠上皮屏障还可有效防止肠道病原菌的侵袭。鉴于肠上皮屏障在IBD中的重要作用，探索缓解上皮屏障功能紊乱的方法，是研究治疗IBD的重要方向[9]。LPS可通过影响NF-κB、JNK信号[10]，调节COX2表达及PGE2生成[11]等作用，导致肠上皮细胞炎症反应，因此，广泛应用于肠上皮细胞的研究中[12, 13]。因为人Caco-2细胞株是来自人结肠癌细胞，其生物学特性不能完全反映原代肠上皮细胞的特征，IEC6更具有代表性，因此，我们采用大鼠肠上皮细胞株IEC6来研究富硒长双歧杆菌对肠上皮细胞屏障的保护作用。
之前的研究表明，硒缺乏可以造成肠道菌群失调，影响肠道微生态平衡，益生菌可以通过调节肠上皮细胞间的连接和通透性，来调节其屏障功能，而富硒益生菌集中了硒元素和益生菌两者的优势。目前国内研究主要集中在饲料添加、增强动物免疫功能和调节脂代谢等方面。国际上的研究也主要和免疫功能及代谢相关[14]，在对于肠上皮细胞屏障的研究中还未见报道。益生菌的种类繁多，本研究我们选择了长双歧杆菌的DD98菌株进行研究。
本研究运用离体模型，研究富硒长双歧杆菌水溶性蛋白对大鼠肠上皮细胞IEC6的保护作用。富硒长双歧杆菌中总硒含量为(0.35±0.05)mg·g-1，其中水溶性蛋白硒含量为(0.26±0.04)mg·g-1，说明硒元素主要存在于水溶性蛋白中。本研究发现，水溶性蛋白能增强IEC6细胞活力，抑制LPS诱导的IEC6细胞凋亡及细胞线粒体膜电位倒塌，从而减少LPS对肠上皮细胞的损伤。
肠上皮细胞屏障与顶端连接复合体(apical junctional complex，AJC)有密切关系，而AJC包含了两类多分子蛋白复合物，分别是紧密连接和黏附连接。紧密连接纤维包含了由几种连接细胞骨架的整合膜蛋白和周边膜蛋白所构成的复合物[15]。整合膜蛋白包括Occludin、连接黏附分子、Claudin家族蛋白和Tricellulin。整合膜蛋白细胞外的部分还能够形成细胞间相互作用，胞质内的N-和C-末端能结合胞质中的ZO-1、ZO-2和ZO-3。ZO蛋白的作用是将紧密连接的胞质组分和肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架连接在一起。因此，Occludin和ZO-1的表达降低将破坏细胞间的连接，导致屏障功能受损。本研究我们也发现，LPS能够降低Occludin和ZO-1的mRNA水平，而富硒长双歧杆菌的水溶性蛋白能抑制LPS的这种作用，提高Occludin和ZO-1的mRNA水平。
综上所述，富硒长双歧杆菌的水溶性蛋白能对肠上皮细胞起到保护作用，并能恢复受损的肠上皮细胞间紧密连接，有利于改善肠道屏障功能。由于水溶性蛋白是富硒长双歧杆菌的主要成分，因此，也预示着该富硒长双歧杆菌DD98有助于在整体水平恢复肠道屏障，改善胃肠道功能。为了安全应用，仍然需要进一步验证益生菌菌株的特异性和富硒长双歧杆菌的水溶性蛋白的剂量依赖性的调节作用。本研究证实益生菌能够促进肠上皮防御能力，为饮食预防和治疗由肠道病原体引发疾病研究提供了科学依据，同时对未来深入研究益生菌维护肠道健康具有一定的指导意义。
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